【摘要】：背景:類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以多關(guān)節(jié)受累為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病,我國患病率約為0.32%-~0.36%,而發(fā)病后一年RA患者的致殘率高達20%,是造成人群勞動力喪失的主要疾病之一。目前臨床上常用的治療藥物主要有激素類藥物、非甾體類抗炎藥、生物制劑等。對于RA的治療,我國RA患者達到低疾病活動度及臨床緩解率遠低于預期,開發(fā)安全有效低毒的藥物具有重要的意義。祖國醫(yī)學在治療本病方面可改善癥狀,協(xié)助西藥控制病情,且不良反應較少。吾師認為類風濕關(guān)節(jié)炎病程超過5年或應用糖皮質(zhì)激素治療后,易出現(xiàn)氣陰兩虛的證候表現(xiàn),這些表現(xiàn)不能用以往的證型分類解釋。在《類風濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》中,吾師主要負責類風濕關(guān)節(jié)炎氣陰兩虛型診治部分的撰寫工作�；谝鏆怵B(yǎng)陰法的理論與臨床依據(jù),并結(jié)合導師多年臨證經(jīng)驗,最終確立治則為益氣養(yǎng)陰通絡法,方藥為四神煎。四神煎收載于清代鮑相之《驗方新編》,具有益氣養(yǎng)陰,通絡止痛的功效,可改善RA患者關(guān)節(jié)疼痛、晨僵、乏力、繼發(fā)的口眼干燥等癥狀,在大量臨床應用過程中療效顯著,但目前國外尚無本法治療類風濕關(guān)節(jié)炎機制研究,國內(nèi)相關(guān)動物實驗研究也較少。RA的近年機制探索,多集中在炎癥信號通路調(diào)控上,眾多炎癥細胞因子直接或間接參與關(guān)節(jié)的炎癥反應。而起主要作用的是促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6等。核轉(zhuǎn)錄因子IRAK1/IKK/NF-κB通路、JAK2-STAT3通路是主要參與發(fā)病的炎癥通路,也是近年研究熱點之一。本實驗研究以上述現(xiàn)狀為出發(fā)點,首先驗證四神煎治療效果,為益氣養(yǎng)陰通絡法改善類風濕關(guān)節(jié)炎的炎癥方面提供重要依據(jù),并通過轉(zhuǎn)錄因子IRAK1/IKK/NF-κB通路、JAK2-STAT3通路探討本法治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制,旨在用科學的方法揭示中醫(yī)藥在該病治療作用方面的獨特優(yōu)勢、為中西醫(yī)結(jié)合治療RA進行一些新的嘗試,為未來新藥創(chuàng)制提供第一手研究資料。目的:觀察益氣養(yǎng)陰通絡法對類風濕關(guān)節(jié)炎SD大鼠炎癥指標的影響、探討IRAK1/IKK/NF-κB、JAK2-STAT3通路的影響及作用機制。方法:SPF級SD大鼠50只,雄性,普通飼料喂養(yǎng),隨機分為5組,每組10只。即正常對照組、模型組、四神煎組、四神煎加甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤組,用佐劑關(guān)節(jié)炎法造模成AIA大鼠,持續(xù)給藥8周。本實驗分三部分。實驗一:益氣養(yǎng)陰通絡法對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥表達的影響1.測定不同組別SD大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度。2.用光鏡觀察不同組別SD大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學改變。3.觀察不同組別SD大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化。4.ELISA法測不同組別SD大鼠血清CRP、ESR、IL-1、IL-6、TNF-α水平。實驗二:益氣養(yǎng)陰通絡法對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠IRAK1/IKK/NF-κB信號通路的影響。Western blot實驗分析大鼠滑膜組織中IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白表達水平,實時熒光定量PCR檢測大鼠滑膜組織中IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平。實驗三:益氣養(yǎng)陰通絡法對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響1.Western blot法檢測大鼠滑膜組織中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平,實時熒光定量PCR檢測大鼠滑膜組織中JAK2、STAT3mRNA表達水平。2.Western blot法檢測大鼠滑膜組織中SOCS3蛋白表達水平,實時熒光定量PCR檢測大鼠滑膜組織中SOCS3mRNA表達水平。結(jié)果:1.與正常組相比,模型組踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);治療8周后,與模型組相比,四神煎組踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組踝關(guān)節(jié)腫脹度與甲氨蝶呤組相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義。2.與正常組相比,正常組大鼠細胞排列整齊,踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無破壞,滑膜組織結(jié)構(gòu)完整無破壞,無炎性細胞浸潤及血管增生性癥狀;模型組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)遭到破壞,滑膜細胞增生變形、纖維化,細胞排列紊亂,有大量炎性細胞浸潤增生及滑膜血管翳形成;大鼠滑膜組織表面增厚,可見炎性細胞浸潤,滑膜細胞排列紊亂,有血管翳形成及少數(shù)軟骨破壞;四神煎組、甲氨蝶呤組軟骨破壞減輕,其滑膜組織增生較前減輕,所觀察到的細胞形態(tài)稍有紊亂,血管翳形成減輕;四神煎+甲氨蝶呤組大鼠軟骨組織相對光滑無破壞,滑膜細胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)相對正常,細胞排列相對整齊,無血管翳形成。3.與正常組相比,模型組造模成功后的踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與模型組相比,四神煎組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.與正常組相比,模型組C反應蛋白、血沉水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組C反應蛋白、血沉水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組C反應蛋白、血沉水平明顯明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組C反應蛋白、血沉水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組C反應蛋白、血沉水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.與正常組相比,模型組TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組的TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組的TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組的TNF-α、IL-1、IL-6水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.與正常組相比,模型組IRAK1、TRAF6、IKK、NF-KB p65蛋白水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組IRAK1、TRAF6、IKK、p65NF-κB蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65蛋白水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.與正常組相比,模型組IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組的IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組IRAK1、TRAF6、IKK、NF-κBp65mRNA水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。8.與正常組相比,模型組p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組的p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組的p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。9.與正常組相比,模型組JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,四神煎組的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎組與甲氨蝶呤組的JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平相當,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);與甲氨蝶呤組相比,四神煎+甲氨蝶呤組JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平明顯低于甲氨蝶呤組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.益氣養(yǎng)陰通絡中藥復方四神煎可改善類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥;益氣養(yǎng)陰通絡法是治療類風濕關(guān)節(jié)炎的有效方法;四神煎加甲氨蝶呤治療類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠療效優(yōu)于單用甲氨蝶呤;四神煎治療類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠與甲氨蝶呤療效大致相同;四神煎加甲氨蝶呤治療類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠療效優(yōu)于單用甲氨蝶呤;益氣養(yǎng)陰通絡中藥復方四神煎可以通過抑制TNF-α、IL-1、IL-6因子水平進而改善類風關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥。2.益氣養(yǎng)陰通絡中藥復方四神煎通過對IRAK1/IKK/NF-κB信號通路的抑制可能是類風濕關(guān)節(jié)炎的抗炎機制之一。3.益氣養(yǎng)陰通絡中藥復方四神煎通過對JAK2-STAT3信號通路及其負反饋因子SOCS3表達的抑制可能是類風濕關(guān)節(jié)炎的抗炎機制之一。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

D E圖 1 四神煎對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響A：正常組；B：模型組；C：四神煎組；D 甲氨蝶呤組；E：四神煎+甲氨蝶呤組；3.四神煎對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分的影響如圖 2 所示，與正常組相比，模型組造模成功后的踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與模型組相比，四神煎組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，甲氨蝶呤組、甲氨蝶呤+四神煎組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與甲氨蝶呤組相比，四神煎組與甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與甲氨蝶呤組相比，四神煎+甲氨蝶呤組踝關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯低于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。

圖 2 四神煎對于類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（ x ±s，n=10）4.四神煎對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學影響由 HE 染色圖圖 3 可知：與正常組相比，正常組大鼠細胞排列整齊，踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無破壞，滑膜組織結(jié)構(gòu)完整無破壞，無炎性細胞浸潤及血管增生性癥狀；模型組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，滑膜細胞增生變形、纖維化，細胞排列紊亂，有大量炎性細胞浸潤增生及滑膜血管翳形成；大鼠滑膜組織表面增厚，可見炎性細胞浸潤，滑膜細胞排列紊亂，有血管翳形成及少數(shù)軟骨破壞；四神煎組、甲氨蝶呤組軟骨破壞減輕，其滑膜組織增生較前減輕，所觀察到的細胞形態(tài)稍有紊亂，血管翳形成減輕；四神煎+甲氨蝶呤組大鼠軟骨組織相對光滑無破壞，滑膜細胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)相對正常，細胞排列相對整齊，無血管翳形成。 如下圖 3 所示,各組 HE 染色病理切片圖片。

四神煎對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠病理組織學的影響

【參考文獻】

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本文編號：2774667