【摘要】：心肌纖維化是眾多心血管疾病,如心肌梗死、冠心病、心肌病等發(fā)展至后期的共同病理改變。如何防治心肌纖維化是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。心肌梗死后心肌纖維化(Cardiac fibrosis after myocardial infraction,CFMI)是心肌纖維化常見(jiàn)的臨床類(lèi)型之一,其核心病理環(huán)節(jié)是CFMI的主要效應(yīng)細(xì)胞心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts,CFs)在氧化應(yīng)激、炎癥因子等促纖維化因素的誘導(dǎo)下,出現(xiàn)增殖、表型分化、遷移、分泌等生物學(xué)行為的改變,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)大量沉積,影響心臟舒縮功能和電信號(hào)傳導(dǎo),出現(xiàn)心力衰竭、心律失常,影響CFMI患者預(yù)后。AMPK介導(dǎo)的Integrin β1信號(hào)通路在CFs參與的ECM過(guò)度沉積中發(fā)揮重要作用�，F(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為,CFMI屬于“胸痹”、“ve瘕”等范疇,與血瘀證的病因病機(jī)密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),活血化瘀中藥在調(diào)節(jié)AMPK代謝通路、優(yōu)化心肌能量代謝的同時(shí),下調(diào)CollagenⅠ、CollagenⅢ、骨橋蛋白、腱糖蛋白-C等ECM關(guān)鍵蛋白,抑制心肌梗死后心室重構(gòu)和心功能異常。但是目前對(duì)于CFMI中ECM表達(dá)情況的研究局限于個(gè)別蛋白,活血化瘀中藥在其中發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制亦尚不明確。水蛭是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中經(jīng)典的活血化瘀中藥,具有破瘀血、通經(jīng)絡(luò)、消ve瘕等確切功效,以及抗凝、抗栓、抗血小板、抗心肌纖維化等藥理作用。目前含水蛭中成藥和水蛭素衍生物比伐蘆定在抗心肌纖維化、減少心梗面積方面獲得一些證據(jù),但缺乏對(duì)水蛭素單一成分抗CFMI的療效和機(jī)制研究。本研究采用Label-free亞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索CFMI主要病理產(chǎn)物ECM的組成特點(diǎn),通過(guò)建立大鼠CFMI模型和AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠CFs模型,以水蛭主要有效組分水蛭素為治療手段,從AMPK介導(dǎo)的Integrinβ1及其下游FAK/PI3K/Akt、TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路,觀察水蛭素對(duì)CFMI修復(fù)過(guò)程中關(guān)鍵ECM蛋白表達(dá)的影響,為中醫(yī)藥延緩CFMI、改善心梗患者預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。1文獻(xiàn)綜述分別闡述CFMI的病理機(jī)制、早期識(shí)別、臨床干預(yù),突出中醫(yī)藥活性成分在CFMI治療中的潛力。對(duì)傳統(tǒng)活血化瘀中藥水蛭的基源、典籍記載、成藥組方、制劑開(kāi)發(fā),以及水蛭主要活性成分水蛭素治療心血管疾病的藥理學(xué)機(jī)制進(jìn)行了綜述,為研究水蛭素干預(yù)CFMI的實(shí)驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ)。2實(shí)驗(yàn)研究研究一心肌梗死后纖維化心肌ECM蛋白表達(dá)譜的構(gòu)建與生信分析目的:通過(guò)Label-free亞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析大鼠CFMI組織中ECM蛋白的組成特點(diǎn)和差異蛋白的互作機(jī)制。方法:采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立Wistar大鼠CFMI模型,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型2周組(Model 2W)、模型4周組(Model 4W),每組10 只。運(yùn)用Label-free亞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析CFMI后2周、4周大鼠心肌ECM差異蛋白改變,GO分析從細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程描述ECM差異蛋白特征,KEGG分析參與ECM差異蛋白表達(dá)的調(diào)控通路,最后通過(guò)Western Blot技術(shù)對(duì)篩選出的ECM差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:共篩選出243個(gè)ECM差異蛋白。與Sham 比較,Model 2W上調(diào)顯著的是骨甘氨酸(Osteoglycin),Model 2W下調(diào)顯著的是巢蛋白-1(Nidogen-1),Model 4W上調(diào)顯著的是光蛋白聚糖(Lumican)、膠原Ⅵ型α2鏈(Collagen 6A2),Model 4W 下調(diào)顯著的是 Nidogen-1;與 Model 2W 比較,Nidogen-1、踝蛋白-1(Talin-1)在Model4W顯著下調(diào)(P0.05)。GO分析顯示,ECM差異蛋白功能顯著富集在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分,受體結(jié)合、金屬離子結(jié)合、Integrin結(jié)合等分子功能,以及免疫調(diào)節(jié)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、膜組織、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附等生物過(guò)程。KEGG分析顯示,黏著斑激酶(FAK)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、Integrinβ1與ECM受體通路顯著富集。Western Blot 結(jié)果顯示,與 Sham 比較,Model 2W 組 Collagen 6A2、Lumican、Talin-1 表達(dá)上調(diào),Model 4W組 Collagen 6A2、Lumican 顯著升高,Nidogen-1 顯著下降(P0.05)。與 Model2W組比較,Model4W 組 Nidogen-1、Lumican、Talin-1 表達(dá)下調(diào)(P0.05)。其中,與 Sham 比較,Model 4W 組 Collagen 6A2、Lumican 表達(dá)上調(diào),Nidogen-1 表達(dá)下調(diào);與 Model 2W 組比較,Model 4W組Nidogen-1、Talin-1 表達(dá)下調(diào),Label-free 結(jié)果與 Western Blot 結(jié)果一致。結(jié)論:參與CFMI發(fā)生的ECM差異蛋白調(diào)控靶點(diǎn)為Collagen 6A2、Nidogen-1、Lumican、Talin-1、Osteoglycin 等,其作用機(jī)制可能涉及 FAK、PI3K/Akt、Integrinβ1等信號(hào)通路。研究二水蛭素調(diào)節(jié)ECM表達(dá)干預(yù)大鼠心梗后心肌纖維化的效應(yīng)機(jī)制目的:觀察水蛭素對(duì)CFMI大鼠心臟功能、血清標(biāo)記物、心肌病理、分子病理的影響,探討水蛭素干預(yù)ECM重建防治CFMI的效應(yīng)機(jī)制。方法:采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立Wistar大鼠CFMI模型,隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham,生理鹽水)、模型組(Model,生理鹽水)、纈沙坦組(Valsartan,144mg·kg-1)、水蛭素組(Hirudin,270mg·kg-1),每組 20 只,每天給藥 1 次,連續(xù)給藥4周。心臟超聲檢測(cè)各組大鼠舒張末期/收縮末期的左室內(nèi)徑(LVD)、室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室容積(EDV/ESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF);血清學(xué)檢測(cè)心肌損傷(CK-MB、cTnT)、心力衰竭(ANP、BNP)、氧化應(yīng)激(Ang Ⅱ、MDA、SOD)等標(biāo)記物;TTC染色、HE染色、Masson染色、天狼星紅染色觀察心肌梗死及纖維化病變情況;免疫組化和Western Blot技術(shù)觀察ECM差異蛋白表達(dá);Western Blot技術(shù)觀察AMPK、Integrin β1、FAK、PI3K p110α PI3K p110(3、Akt、TGF-β1、Smad2/3 等信號(hào)通路蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)與 Sham 組比較,Model 組 IVST、LVPWT 減少,LVD、EDV、ESV增高,LVEF降低(P0.05),提示CFMI模型建立成功。與Model組比較,Hirudin 組 IVSTs、LVPWT、LVEF 升高,LVD、EDV、ESV 降低(P0.05)。(2)與 Model 組比較,Valsartan 組、Hirudin 組 CK-MB、cTnT、ANP、BNP、Ang Ⅱ、MDA水平顯著下降,SOD顯著升高(P0.05)。(3)與Model組比較,Valsartan組、Hirudin組心重指數(shù)、心梗面積減少,膠原容積分?jǐn)?shù)顯著降低;Hirudin組血管周?chē)z原容積分?jǐn)?shù)顯著降低(P0.05)。與Model組比較,Valsartan組、Hirudin 組 Collagen 6A2、Lumican 表達(dá)減少,Nidogen-1 表達(dá)增多(P0.05)。(4)與 Model 組比較,Valsartan 組、Hirudin 組 AMPKα、FAK、PI3K p110α、Akt蛋白活性上調(diào),Integrinβ1、TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05),PI3K p110β蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P0.05)。結(jié)論:水蛭素能夠改善CFMI大鼠左室擴(kuò)張,提高心臟功能,減輕心肌損傷,減少心重指數(shù)、心梗面積,減輕心肌組織和血管周?chē)z原沉積,從而延緩CFMI進(jìn)展;其機(jī)制與調(diào)節(jié)Collagen 6A2、Lumican、Nidogen-1等ECM差異蛋白代謝,調(diào)控心肌 AMPKα/Integrin β1/FAK 及其介導(dǎo)的下游 PI3K/Akt、TGF-β1/Smad2/3 信號(hào)通路有關(guān)。研究三水蛭素干預(yù)Ang Ⅱ誘導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞ECM表達(dá)的機(jī)制目的:通過(guò)Ang Ⅱ誘導(dǎo)乳大鼠心肌成纖維細(xì)胞(NRCFs)模型,觀察水蛭素對(duì)NRCFs形態(tài)、增殖、表型分化、遷移、分泌等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制。方法:分離、提取、培養(yǎng)NRCFs,經(jīng)免疫熒光鑒定波形蛋白(+)/vWF(-)后,給予不同濃度(10-9 mol·L-1、10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1)AngⅡ誘導(dǎo)不同時(shí)間(6h、12h、24h、48 h),采用CCK-8法觀察NRCFs增殖活力,確立Ang Ⅱ誘導(dǎo)NRCFs促纖維化模型的適宜濃度和時(shí)間。NRCFs分為4組:對(duì)照組(Control)、模替型組(Ang Ⅱ)、纈沙坦組(Valsartan)、水蛭素組(Hirudin),給予相應(yīng)藥物預(yù)干預(yù)30 min后加入Ang Ⅱ誘導(dǎo)NRCFs。采用流式細(xì)胞法觀察各組NRCFs細(xì)胞周期,α-SMA法觀察NRCFs表型轉(zhuǎn)化,Transwell小室試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)觀察NRCFs遷移,HYP含量測(cè)定法觀察NRCFs膠原蛋白分泌,免疫熒光染色技術(shù)觀察ECM差異蛋白分泌情況,Western Blot技術(shù)觀察AMPKα1/α2、Integrinβ1、FAK、TGF-β1、Smad2/3、Nideogen-1 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:(1)NRCFs培養(yǎng)24h后生長(zhǎng)良好,波形蛋白(+)/vWF(-)的NRCFs比例在(98.09±1.03)%。選定 Ang Ⅱ以10-6mol·L-1刺激24h作為誘導(dǎo)NRCFs纖維化改變的理想模型。(2)與Ang Ⅱ組比較,Valsartan組、Hirudin組靜止期G0G1期細(xì)胞百分比增多、增殖期S期細(xì)胞百分比降低,α-SMA免疫熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量、穿越Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量減少,劃痕寬度延長(zhǎng)(P0.05)。(3)與 Ang Ⅱ 組比較,Valsartan 組、Hirudin 組 HYP 含量降低,Lumican、Collagen 6A2熒光強(qiáng)度下降,Hirudin組Nidogen-1、Talin-1熒光強(qiáng)度升高(P0.05)。(4)與Ang Ⅱ組比較,Valsartan組、Hirudin組AMPKα1/α2、FAK表達(dá)上調(diào),Integrin β1 表達(dá)下調(diào),Valsartan 組 TGF-β1、Smad2/3 表達(dá)下調(diào)(P0.05);Hirudin組 TGF-β1、Smad2/3,Valsartan 組、Hirudin 組 Nidogen-1 表達(dá)無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論:水蛭素能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NRCFs增殖、表型分化、遷移、分泌等細(xì)胞生物學(xué)行為的改變,其機(jī)制與調(diào)節(jié)AMPK/Integrin β1/FAK信號(hào)通路表達(dá),進(jìn)而優(yōu)化NRCFs對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的促纖維化因素的處理能力有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院二0一六級(jí)博士研究生學(xué)位論文逡逑２邋ＥＣＭ重建規(guī)律衍變與心梗后心肌纖維化發(fā)展逡逑ＣＦＭＩ的發(fā)生大致可以分為相互重疊的３個(gè)階段：炎癥期（損傷造成炎癥因逡逑子和細(xì)胞因子釋放，心肌原有ＥＣＭ網(wǎng)絡(luò)破壞，血漿衍生的臨時(shí)ＥＣＭ形成）、逡逑增殖期（炎癥因子促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的增殖和遷移，血漿衍生的臨時(shí)ＥＣＭ分解，細(xì)逡逑胞來(lái)源的ＥＣＭ大量分泌）、修復(fù)期（成熟的膠原基質(zhì)疤痕形成，心臟結(jié)構(gòu)和功逡逑能發(fā)生改變）［４］。對(duì)于嚙齒動(dòng)物（如鼠類(lèi)），炎癥期在急性心肌梗死（Ａｃｕｔｅ逡逑ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ邋ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＡＭＩ）發(fā)生的４８邋ｈ內(nèi)，增殖期在ＡＭＩ后的２？９天，修復(fù)逡逑期持續(xù)１個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間；對(duì)于體型更大的哺乳動(dòng)物，炎癥期發(fā)生在ＡＭＩ后的逡逑７天以?xún)?nèi)，增殖期在ＡＭＩ后的數(shù)天？２周，而修復(fù)期持續(xù)２個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間逡逑Ｗ。在整個(gè)梗死愈合過(guò)程中，ＥＣＭ重建規(guī)律的動(dòng)態(tài)衍變?cè)谡{(diào)節(jié)心臟修復(fù)反應(yīng)及逡逑纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［６１。逡逑

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院二0一六級(jí)博士研究生學(xué)位論文逡逑２邐ＥＣＭ邋蛋白質(zhì)邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑各組樣本ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結(jié)果見(jiàn)圖１。各組樣品蛋白在１０邋ＫＤａ？１７０邋ＫＤａ之逡逑間條帶清晰，分布均勻，聚集模式相似，表明樣品間具有可比性。逡逑Ｍａｃ丨提取物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳邐ＣｉｕＭＣｌ提Ｗ物ＳＤＳ－剛；￡電泳逡逑Ｍ（ｋＤａ）N邋上邋邐５邐６邐７＾邋上上邐！邐２３４邐５邋ｆｅ邋７邐？邐９逡逑；：，■，，＞；邋？邐ｗ，邋：邐—逡逑１７０邋－＾邋＾邋＾邋＾邋…．邋＾逡逑Ｊ００逡逑１00邋一卜Ｐ＿邐ｗ：：二＾＾。：卜一，．一邐卜？妒、，一，？”一，鱒逡逑７０邐＾邐＾邐ｙ）邐一…彟＇…＾逡逑Ｓ５邋ｂ＿＊ｊｓ？邋；：．：邐務(wù)吻砂．＊邐．－■－邋■邐—逡逑４０邐＿ｗｉｆ邋

本文編號(hào)：2773406