【摘要】：隨著當(dāng)代醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展,人們對耳部相關(guān)的疾病有了越來越深入的研究,因此防治毛細(xì)胞損傷的研究正迎來一個新的春天。目前治療耳聾的方法有使用藥物治療,基因治療,干細(xì)胞療法等。我國天然藥物資源蘊藏豐富,中藥是眾多藥物庫中的一個重要構(gòu)成,它在防治藥源性耳聾方面的研究也日漸增加�；诩{米制劑可以提高或改善藥物的生物利用度,因此在近幾年引起了研究者們的關(guān)注。在現(xiàn)代的臨床用藥中已表明氨基糖苷類是非常有效的抗菌劑;順鉑是一種化學(xué)治療劑,常用于治療癌癥(如肺癌,前列腺癌等),但眾所周知的是,它們的使用會引起耳毒性,極大地影響病人的生活質(zhì)量。因此,在能夠保持順鉑或慶大霉素藥效的同時,降低它們的耳毒性是目前研究人員面臨的重大挑戰(zhàn),本研究對細(xì)胞和斑馬魚分別進行慶大霉素,順鉑的造模,從224種中藥提取物中篩選出有效的組分,并初步構(gòu)建其納米制劑,為進一步發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)防耳毒性藥物及制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究以小鼠耳蝸毛細(xì)胞系HEI-OC1細(xì)胞為模型,經(jīng)過實驗考察,利用慶大霉素或順鉑造模條件分別為10 mM和40μM作用細(xì)胞24 h,并且選擇40μM EDA作為慶大霉素造模的陽性藥,1 mM NAC作為順鉑造模時的陽性藥。篩選了224種中藥提取物,實驗發(fā)現(xiàn)了有13種中藥提取物既有慶大霉素,又有由順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞損傷的預(yù)防作用,使用有效提取物進行預(yù)孵育后,細(xì)胞存活率有明顯提高。以野生型AB系斑馬魚幼魚為模型,經(jīng)過實驗考察,利用慶大霉素和順鉑造模條件分別為100μM和1 mM分別作用細(xì)胞1 h和4 h,并且選擇80μg/mL EDA作為慶大霉素造模的陽性藥,40μg/mL NAC作為順鉑造模時的陽性藥。實驗發(fā)現(xiàn)有2種中藥提取物既有慶大霉素,又有順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞損傷的預(yù)防作用,使用有效提取物進行預(yù)孵育后,斑馬魚神經(jīng)丘的毛細(xì)胞損傷程度有明顯降低。進一步探討了篩選出來的有效提取物是否會影響慶大霉素的抑菌療效和順鉑的抗肺癌活性,以及是否會促進毛細(xì)胞的再生。采用MTT法測定非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的存活率,紙片法測定慶大霉素的抑菌療效,Brdu標(biāo)記法考察斑馬魚毛細(xì)胞的再生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),13種有效提取物既不會影響順鉑的抗癌作用,也不會影響慶大霉素的抑菌療效,并且有效提取物對毛細(xì)胞預(yù)防作用的機制是使毛細(xì)胞免受到慶大霉素的損害,而不是促進毛細(xì)胞的快速再生。最后,初步研究制備包載有效提取物的殼聚糖納米粒,并考察了包載尼羅紅的殼聚糖納米粒在斑馬魚幼魚中的攝取情況,斑馬魚攝取試驗表明在裝載尼羅紅的殼聚糖納米粒與幼魚作用1小時后,可明顯看到納米粒能夠被斑馬魚大量攝取,藥效實驗表明包載有效提取物殼聚糖納米粒對慶大霉素或順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞和斑馬魚損傷均具有預(yù)防作用。綜上所述,本研究結(jié)果表明,以慶大霉素或順鉑所致的HEI-OC1細(xì)胞和斑馬魚幼魚毛細(xì)胞損傷模型,將有望成為新型大規(guī)模篩選出預(yù)防耳毒性藥物的平臺。篩選出來的兩種提取物對慶大霉素或順鉑所致的耳毒性具有預(yù)防和治療作用,并且包載有效提取物的殼聚糖納米制劑在防治耳聾領(lǐng)域具有一定的潛在應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;R283.6
【圖文】：

學(xué)差異（P<0.001），因此選擇的造模條件分別為 10 mM 慶大霉素或 40 μM 的順鉑孵育 24 h。圖2-1 慶大霉素（A）和順鉑（B）對HEI-OC1細(xì)胞毒性Fig. 2-1 Cytotoxicity of gentamicin (A), CDDP (B) when incubated with HEI-OC1 Cells asdetermined by MTT assay. *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. control group. Results wereshown as mean±SD (n = 6) .2.3.2 陽性藥的考察使用不同濃度的 EDA（0，5，10，20，40，80 μM）作用 24 小時后，采用MTT 法測出其對 HEI-OC1 細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)在 0-80 μM 濃度范圍內(nèi)的 EDA（EDA）對 HEI-OC1 細(xì)胞的存活率無影響

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文用不同濃度的 EDA（0，10，20，40μM）預(yù)處理 HEI-OC1 細(xì)胞 1 小時后終濃度為 10 mM 的慶大霉素繼續(xù)孵育 24 小時，結(jié)果顯示加 20，40 與未加的相比，細(xì)胞存活率顯著性增加，且有統(tǒng)計學(xué)意義，說明 EDA素引起的 HEI-OC1 細(xì)胞損傷具有預(yù)防作用，見圖 2-2C。先用不同濃度0，0.5，1 mM）預(yù)處理 HEI-OC1 細(xì)胞 1 小時后，再加入終濃度為 40 繼續(xù)孵育 24 小時，發(fā)現(xiàn)加入 0.5，1mMEDA 的與未加的相比，細(xì)胞存性增加，且有統(tǒng)計學(xué)意義，說明 NAC 對順鉑引起的 HEI-OC1 細(xì)胞損傷作用，見圖 2-2D。當(dāng) EDA 和 NAC 的濃度分別大于 40 μM 和 1 mM 時始死亡，因此選擇 EDA（作為慶大霉素造模的陽性藥）和 NAC（作為時的陽性藥）的最佳保護濃度分別為 40 μM 和 1 mM。

結(jié)果也提示如此。給藥組與正常對照組相比，慶大霉素的濃度為 100 μM 時,毛細(xì)胞數(shù)量下降約為正常對照組的 50%，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001）。圖3-1 慶大霉素?fù)p傷5 dpf的斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞DASPEI染色(A)及計數(shù)(B), *P < 0.05, **P<0.01,***P <0.001 vs. 對照組。Fig. 3-1 DASPEI staining (A) and counting (B) of hair cells in zebrafish lateral lineafter gentamicin injury. *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. control group.

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本文編號：2771878