【摘要】：目的腦立體定位技術向大鼠海馬注入紅藻氨酸(KA)建立癲癇模型,利用復方丹參滴丸(CDDP)、丙戊酸鈉(VPA)單獨治療和聯(lián)合治療,通過水迷宮和八臂迷宮實驗考察聯(lián)合治療對大鼠行為學、學習記憶能力、空間參照記憶能力的影響,尼氏染色法考察對大鼠神經(jīng)元損傷的影響,UPLC-MS/MS法考察CDDP對VPA血藥濃度的影響,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)考察對大鼠腦組織和血清中CRP、IL-6、TNF-α水平的影響,實時熒光定量PCR和Western Blot法考察對凋亡因子Caspase3、Caspase8基因和蛋白的影響,從而驗證VPA聯(lián)合CDDP對癲癇大鼠是否具有更好的抗癇作用并為臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。方法1.將SD雄性大鼠采用腦立體定位技術向海馬內注入紅藻氨酸(KA)(生理鹽水組注入一定量的生理鹽水)建立癲癇模型,根據(jù)Racine等級篩選出點燃成功的模型。之后隨機分為模型組(Model)、生理鹽水組(Saline)、丙戊酸鈉組(VPA)、復方丹參滴丸組(CDDP)、丙戊酸鈉聯(lián)合復方丹參滴丸組(VPA+CDDP),每組8只大鼠。模型組和生理鹽水組分別灌胃給予一定劑量的生理鹽水,其余各組給予相應的藥物,分別于給藥30d、60d后通過Morris水迷宮和八臂迷宮考察對癲癇大鼠行為學、學習記憶能力、空間參照記憶能力的影響。2.在灌胃60d后的大鼠中隨機選取4只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后用4%多聚甲醛和生理鹽水心臟灌注至四肢僵直,快速斷頭取腦并用多聚甲醛固定,通過尼氏染色和神經(jīng)元計數(shù)觀察大鼠海馬及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷情況。3.將癲癇大鼠隨機分為VPA組和VPA+CDDP組,每組5只。VPA+CDDP組以CDDP連續(xù)灌胃給藥7天后,第8天時兩組大鼠再分別灌胃給予VPA,在不同時間點進行眼眶采血,通過UPLC-MS/MS法測定VPA血藥濃度,DAS 3.0軟件繪制藥時曲線,研究CDDP對癲癇大鼠體內VPA血藥濃度的影響。4.在灌胃60d后的每組大鼠中隨機選取5只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,采集大鼠血液和腦組織,分離出血清以及處理得到腦組織勻漿后用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠腦組織和血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量。5.在灌胃60d后的每組大鼠中隨機選取6只,腹腔注射10%水合氯醛,斷頭取腦,快速剝離出海馬,處理后通過實時熒光定量PCR和Western Blot法測定大鼠凋亡因子Caspase3、Caspase8的基因和蛋白的表達情況。結果1.定位航行實驗中隨著訓練時間的增加,各組大鼠逃避潛伏期均有所下降,且其余各組與同期模型組大鼠逃避潛伏期相比均明顯減少(P0.01)。30d時,與單用VPA相比VPA+CDDP組逃避潛伏期有所減少但無統(tǒng)計學意義(P0.05);60d時與單用VPA組相比VPA+CDDP組所用時間明顯減少(P0.05,P0.01);空間探索實驗中,與模型組比較其余各組穿越平臺次數(shù)均有不同程度的增多,且60d時VPA+CDDP組較單用VPA組顯著增多(P0.01)。八臂迷宮中,其余各組的參考記憶錯誤次數(shù)、工作記憶錯誤次數(shù)和吃完食物總時間均低于模型組,且60d時VPA+CDDP各項指標較單用VPA組均顯著降低(P0.05)。2.尼氏染色中與模型組相比,各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)目均有所增多,且VPA+CDDP組與單用VPA組相比顯著增多(P0.05)。3.與單用VPA組相比,聯(lián)合組大鼠藥動學參數(shù)中曲線下面積(AUC_((0-8h))和AUC_((0-∞)))、峰濃度(C_(max))、達峰時間(T_(max))均顯著性提高(P0.01,P0.05),清除率(CL_(Z/F))顯著降低(P0.05)。半衰期(T_(1/2z))、表觀分布容積(V_(z/F))均有不同程度的提高。4.與模型組相比,其余各組大鼠腦組織和血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量均顯著降低(P0.01)。VPA+CDDP組較單用VPA組腦組織中CRP含量顯著降低(P0.01),IL-6和TNF-α水平VPA+CDDP組較VPA組均有所降低但無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.與模型組相比,VPA+CDDP和對照組Caspase3基因表達量均顯著減少(P0.01),與單用VPA相比VPA+CDDP組Caspase3基因表達量顯著減少(P0.05);與對照組相比其余各組Caspase8的基因表達量均顯著增加(P0.01,P0.05),而VPA+CDDP組與單用VPA組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.與模型組相比,其余各組Caspase3、Caspase8蛋白的表達量顯著減少(P0.01);且與單用VPA相比,VPA+CDDP組Caspase3和Caspase8蛋白表達量均顯著減少(P0.01)。結論丙戊酸鈉聯(lián)合復方丹參滴丸可增加丙戊酸鈉在癲癇大鼠體內的分布,提高其血藥濃度;而且可以更好的改善癲癇大鼠的學習記憶能力和空間參照記憶能力,減少神經(jīng)元受損,其機制可能是通過減少腦內CRP等炎癥因子而調節(jié)炎癥反應或者是通過調控凋亡因子Caspase3、Caspase8從而減少細胞凋亡。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

VPA VPA+CDDP圖 2-1 各組大鼠在 Morris 水迷宮中搜索平臺策略圖2.6.2 30d 時各組大鼠學習記憶能力的變化2.6.2.1 30d 大鼠定位航行實驗所用時間比較各組大鼠每天定位航行實驗所用時間如表 2-1，圖 2-2，與模型組相比，生理鹽水組和 VPA+CDDP 組大鼠所用時間均明顯縮短（P<0.01，P<0.05）；且隨著訓練時間的延長，各組大鼠所用時間均有所減少，其余各組與 VPA+CDDP 組和 VPA 組相比逐漸呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.01）。雖然與單用 VPA 組比較，VPA+CDDP 組大鼠所用時間并無統(tǒng)計學差異（P>0.05），但是 VPA+CDDP 組所用時間相對 VPA 組有所減少。

州大學碩士研究生學位論文 丙戊酸鈉聯(lián)合復方丹參滴丸對癲癇大鼠抗癇作用的.3 實驗結果染色結果如圖 3-1，3-2，由圖可知，生理鹽水組較其余組尼氏小體分布正較豐富，神經(jīng)元排列整齊，海馬組織結構完整，而其它組海馬和 CA3 區(qū)均了不同程度的神經(jīng)元丟失的情況。其中，模型組海馬和 CA3 區(qū)神經(jīng)元丟失，數(shù)目嚴重減少，尼氏小體嚴重減少甚至消失。而與模型組相比，各組大鼠 CA3 區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)目均有所增多，聯(lián)合組海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元細胞有顯著（P<0.01）；而 VPA+CDDP 組與單用 VPA 組相比明顯增多，且具有統(tǒng)計異（P<0.05）。

21圖 3-2 各組大鼠 CA3 區(qū)尼氏染色圖片（x200）圖 3-3 各組大鼠海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元數(shù)目注：與生理鹽水組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.05，與丙戊酸鈉組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.05。102030405060708090100110120▲▲▲▲▲****△△△△△△numberofsurvingneuronsSaline Model CDDPVPA VPA+CDDP△△***▲▲

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1 張景梅;梁洪s

本文編號：2771785