【摘要】：糖尿病是以糖脂代謝紊亂為主要臨床特征的慢性代謝性疾病,其中心血管疾病是糖尿病的主要并發(fā)癥,約60%的糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。越來越多的證據(jù)表明,糖脂代謝紊亂引發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老是導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂及心血管疾病的關(guān)鍵。衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠活化和分泌大量促炎細(xì)胞因子,促進慢性炎癥擴散、單核細(xì)胞聚集和血栓形成,加速血管內(nèi)皮功能紊亂和糖尿病心血管疾病形成。因此,探討高糖高脂環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的病理機制,尋找靶向干預(yù)衰老細(xì)胞的治療措施,對糖尿病及心血管并發(fā)癥的防治意義重大。糖尿病患者體內(nèi)高糖高脂刺激損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)累積,誘導(dǎo)長期氧化應(yīng)激反應(yīng),加速血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老形成。線粒體自噬是選擇性自噬的一種形式,它可以標(biāo)記受損的線粒體,并對其進行自動識別和降解,從而改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性,阻止線粒體來源的ROS的過度累積,進而在延緩細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮保護作用。AMPK/mTOR信號通路作為經(jīng)典的線粒體自噬調(diào)控通路,也參與了多種心血管和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。因此,調(diào)控AMPK/mTOR信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬有望成為延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的新策略。中藥人參、三七、川芎均屬于益氣活血藥的范疇,臨床廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治。既往藥理學(xué)研究顯示,上述三種中藥的多種活性成分均具有良好的抗衰老功效。本課題組前期研究表明,在復(fù)制型和誘導(dǎo)型的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老中,人參三七川芎提取物均能有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,發(fā)揮延緩細(xì)胞衰老的作用。但是,在高糖高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老中,人參三七川芎提取物是否能有效地抑制細(xì)胞衰老的發(fā)生發(fā)展?其具體機制是否與線粒體自噬和AMPK/mTOR信號通路有關(guān)?上述科學(xué)問題均有待進一步探索�；诖�,我們提出以下科學(xué)假說:人參三七川芎提取物可能通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬延緩高糖高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老。圍繞上述假說,本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,預(yù)測人參、三七和川芎延緩血管衰老的可能作用靶點和分子機制,然后以糖尿病小鼠主動脈和人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,以線粒體自噬與AMPK/mTOR信號通路為切入點,探索人參三七川芎提取物與高糖高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老之間的關(guān)系,旨在從網(wǎng)絡(luò)藥理、整體動物和細(xì)胞分子三個水平闡述人參三七川芎提取物延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用及機制。研究一人參三七川芎延緩血管衰老的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究目的:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析人參、三七和川芎延緩血管衰老可能的作用靶點和分子機制。方法:檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫,以 口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)為限定條件對人參、三七和川芎所含的活性成分進行篩選,并預(yù)測作用靶點;利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)、成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)和血管衰老相關(guān)靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò);采用BisoGenet插件,將上述中藥活性成分作用靶點和人類血管衰老相關(guān)疾病靶點進行相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制,抽取獲得人參、三七和川芎延緩血管衰老的關(guān)鍵靶標(biāo);采用ClueGO分析插件,將上述篩選得到的關(guān)鍵靶標(biāo)進行KEGG信號通路富集分析。結(jié)果:通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為參數(shù)從中藥人參、三七和川芎中收集到了 33個入血活性成分,130個預(yù)測靶點;從NCBI、AgeFactDB和HAGR數(shù)據(jù)庫篩選獲得146個人血管衰老相關(guān)基因;構(gòu)建中藥調(diào)控血管衰老的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò),通過拓?fù)鋵傩苑治龊Y選獲得253個關(guān)鍵靶標(biāo);ClueGO富集分析顯示人參、三七和川芎延緩血管衰老的機制涉及細(xì)胞周期、長壽調(diào)節(jié)通路、FoxO信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、線粒體自噬等多種生物過程。結(jié)論:人參、三七和川芎延緩血管衰老具有多成分、多途徑和多靶點綜合調(diào)控的作用特點,其中線粒體自噬很可能是關(guān)鍵調(diào)控點之一。研究二人參三七川芎提取物對高糖高脂環(huán)境下血管組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響目的:觀察人參三七川芎提取物對糖尿病小鼠主動脈衰老和高糖高脂誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響。方法:通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建糖尿病小鼠模型,造模28 w后給予藥物干預(yù)9 w,實驗分為空白對照組、衰老模型組、人參三七川芎提取物低(0.819 g/kg)、高(1.638 g/kg)劑量組和二甲雙胍組(150 mg/kg)。利用生化分析小鼠血糖血脂變化,細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法計算藍(lán)染組織比例,免疫組化和Western blot檢測p16和p21蛋白表達情況。體外實驗采用40mM葡萄糖(high glucose,HG)和 100μM 棕櫚酸(palmitic acid,PA)干預(yù) 48h 誘導(dǎo)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAEC)衰老模型,實驗分為空白對照組、衰老模型組、人參三七川芎提取物不同劑量組和二甲雙胍組。采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力,SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老程度,Western blot檢測細(xì)胞p16、p21蛋白表達水平的變化,免疫熒光檢測Y-H2A.X(Ser139)表達、線粒體ROS(mitochondrial ROS,mtROS)生成和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)變化。結(jié)果:(1)與空白對照組相比,衰老模型組小鼠隨機血糖、膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著升高,高密度脂蛋白水平降低,主動脈組織SA-β-gal藍(lán)染比例增加,p16、p21蛋白表達水平升高(P0.05);藥物干預(yù)后,小鼠血糖水平降低(P0.05),各項血脂指標(biāo)改變不明顯,主動脈組織SA-β-gal藍(lán)染比例明顯降低(P0.05),p16、p21蛋白表達水平下調(diào)(P0.05)。(2)體外實驗中,與空白對照組相比,衰老模型組HAEC細(xì)胞增殖活力、MMP水平降低(P0.05),SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量和mtROS生成增加,p16、p21和Y-H2A.X(Ser139)蛋白表達水平升高(P0.05);與衰老模型組比較,人參三七川芎提取物組和二甲雙胍組中HAEC細(xì)胞增殖活力和MMP水平增加(P0.05),SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量和mtROS生成減少(P0.05),p16、p21和Y-H2A.X(Ser139)的表達水平顯著降低(P0.05)。結(jié)論:長期高糖高脂刺激可加速小鼠主動脈和HAEC細(xì)胞衰老進程,而人參三七川芎提取物能夠同時延緩血管組織和HAEC細(xì)胞衰老,且對HAEC細(xì)胞線粒體功能和mtROS的生成有明顯干預(yù)作用,其可能通過此作用抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進程。研究三人參三七川芎提取物調(diào)控線粒體自噬抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用目的:觀察人參三七川芎提取物在血管內(nèi)皮細(xì)衰老中對線粒體自噬的影響,并特異性抑制線粒體自噬,進一步探討人參三七川芎提取物抑制細(xì)胞衰老的可能機制。方法:采用HG 40mM聯(lián)合PA 100μM干預(yù)48h誘導(dǎo)HAEC細(xì)胞衰老模型,實驗分為空白對照組、衰老模型組、人參三七川芎提取物組和二甲雙胍組。采用GFP-LC3與mitotracker熒光共定位檢測評估線粒體自噬體的形成,Parkin與mitotracker熒光共定位檢測評估Parkin蛋白轉(zhuǎn)位情況,Western blot檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3B-Ⅱ、p62和衰老相關(guān)蛋白p16、p21的表達水平,CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力,SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老程度,免疫熒光檢測γ-H2A.X(Ser139)表達、mtROS 生成和 MMP 變化。結(jié)果:(1)與空白對照組相比,衰老模型組HAEC細(xì)胞中GFP-LC3與mitotracker共定位程度下降,Parkin蛋白表達與轉(zhuǎn)位程度下調(diào),p62表達增加;與衰老模型組相比,人參三七川芎提取物組GFP-LC3、Parkin與mitotracker共定位程度增加(P0.05),Parkin和LC3B-Ⅱ的表達水平上調(diào)(P0.05),而p62表達水平下調(diào)(P0.05);二甲雙胍組GFP-LC3與mitotracker共定位程度和Parkin、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平均上調(diào)(P0.05)。(2)給予Mdivi-1抑制線粒體自噬,與衰老模型組相比,人參三七川芎提取物組GFP-LC3和mitotracker共定位程度、Parkin的表達和轉(zhuǎn)位情況均未發(fā)生改變;LC3B-Ⅱ和p62表達水平上調(diào)(P0.05);mtROS生成、MMP水平、細(xì)胞增殖活性、SA-β-gal藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量和p16、p21、γ-H2A.X(Ser139)蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:高糖高脂刺激可抑制HAEC細(xì)胞線粒體自噬,人參三七川芎提取物能夠恢復(fù)HAEC細(xì)胞線粒體自噬能力,這可能是其發(fā)揮改善線粒體功能、減少mtROS生成和延緩細(xì)胞衰老的重要機制之一。研究四人參三七川芎提取物通過AMPK/mTOR通路發(fā)揮線粒體自噬調(diào)控作用目的:觀察人參三七川芎提取物在血管內(nèi)皮細(xì)衰老中對AMPK/mTOR信號通路的影響。通過特異性干擾AMPK活性與表達,進一步探討人參三七川芎提取物調(diào)控線粒體自噬及延緩細(xì)胞衰老的作用機制。方法:采用HG 40mM聯(lián)合PA 100μM干預(yù)48h誘導(dǎo)HAEC細(xì)胞衰老模型,實驗分為空白對照組、衰老模型組、人參三七川芎提取物組和二甲雙胍組。采用Western blot檢測p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K和p70S6K蛋白表達;采用Compound C和AMPKα1 shRNA慢病毒顆粒干擾AMPK活性和表達,在此基礎(chǔ)上,觀察對人參三七川芎提取物調(diào)控AMPK/mTOR信號通路、線粒體自噬和細(xì)胞衰老程度作用的影響。結(jié)果:(1)與空白對照組相比,衰老模型組HAEC細(xì)胞中AMPK蛋白和磷酸化(Thr172)水平下調(diào),mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平上調(diào);藥物干預(yù)后,可有效上調(diào)AMPK蛋白表達及磷酸化水平,下調(diào)mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平,具有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)給予Compound C抑制AMPK活性,與衰老模型組相比,藥物干預(yù)后,AMPK、mTOR和p70S6K磷酸化水平?jīng)]有差異;未能增加HAEC細(xì)胞中LC3、Parkin與線粒體的結(jié)合程度;PINK1、Parkin、p62和LC3B-Ⅱ的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義;HAEC細(xì)胞增殖活力、SA-β-gal細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量、mtROS生成以及p16、p21和γ-H2AX蛋白表達方面尚未有差異。(3)采用RNAi技術(shù)特異性干擾AMPKα1蛋白表達,與陰性對照組(SCR shRNA)比較,AMPKα1 shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AMPK蛋白表達及磷酸化水平顯著下調(diào),同時mTOR和p70S6K磷酸化水平上調(diào);Parkin蛋白表達水平顯著下調(diào),p62蛋白表達水平上調(diào);細(xì)胞增殖活力水平下降,SA-β-gal細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量、mtROS生成以及p16、p21和γ-H2AX蛋白表達增加。(4)在AMPKα1 shRNA干擾細(xì)胞中,與衰老模型組相比,人參三七川芎提取物組中AMPK蛋白表達和磷酸化水平無統(tǒng)計學(xué)差異,mTOR和p70S6K磷酸化水平下調(diào),但是其下調(diào)程度較結(jié)果(1)中明顯減弱;PINK1、Parkin和LC3B-Ⅱ蛋白表達水平未有明顯差異,p62蛋白水平明顯下調(diào);細(xì)胞增殖活力、SA-β-gal細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量、mtROS生成以及p21蛋白表達方面尚未有差異,但p16和γ-H2AX蛋白水平明顯下調(diào)。結(jié)論:AMPK/mTOR信號通路在高糖高脂誘導(dǎo)的衰老HAEC細(xì)胞中呈抑制狀態(tài),人參三七川芎提取物可激活該通路,這是其發(fā)揮激活線粒體自噬和拮抗細(xì)胞衰老作用的重要機制之一。綜上所述,本研究利用糖尿病小鼠模型和HG/PA聯(lián)合誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞衰老模型,證明人參三七川芎提取物可呈劑量依賴性的延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老,以往未見報道。在此基礎(chǔ)上,本研究基于“AMPK/mTOR信號通路-線粒體自噬-線粒體功能障礙”軸闡明了高糖高脂環(huán)境下人參三七川芎提取物延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的效應(yīng)機制,為糖尿病及心血管疾病的中醫(yī)藥防治提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

為了更好地理解中藥活性成分與對應(yīng)靶點之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，本研究逡逑以上述活性成分和靶點為基礎(chǔ)，采用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ進行繪制和分析，逡逑建立了成分靶點網(wǎng)路圖。該網(wǎng)絡(luò)包含了邋１５８個節(jié)點和６４５個關(guān)系（

庫之間的重復(fù)的衰老相關(guān)基因之后，獲得丫邋３０９個人衰老相關(guān)基因。最后匯集了逡逑１７２６個人血管相關(guān)基因和３０９個人衰老相關(guān)基因，并生成了邋１４６個人血管衰老逡逑相關(guān)基因，用于基于系統(tǒng)藥理學(xué)的分析（

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進一步深入分析中藥人參、三七和川芎影響血管衰老發(fā)生、逡逑發(fā)展的靶點，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點的交集網(wǎng)絡(luò)，為中藥干預(yù)血管衰老的機制逡逑探討提供了可靠依據(jù)（圖３）。逡逑、：－－逡逑？邋＊邐ｒ逡逑＾邐－邋．Ｖ、、逡逑？ｌ邋？邋？邋＞逡逑．＇邋．Ｖ－逡逑？＂Ｖ．少、？逡逑４邋．邋－，邐．逡逑圖３中藥－血管衰老交集網(wǎng)絡(luò)圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｖａｓｃｕｌａｒ邋ａｇｉｎｇ邋ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ邋ｎｅｔｗｏｒｋ逡逑４．２中藥調(diào)控血管衰老的關(guān)鍵靶點逡逑通過對中藥人參、三七和川芎調(diào)控血管衰老的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)逡逑絡(luò)節(jié)點的拓?fù)鋵傩苑治鲞M行節(jié)點篩選，尋找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。本研究篩選獲得逡逑２５３個節(jié)點和９１３５條邊，其中２５３個節(jié)點即為中藥人參、三七和川芎調(diào)控血管逡逑衰老的２５３個關(guān)鍵靶點（圖４）。逡逑４２逡逑

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本文編號：2769880