【摘要】：蠶砂提取物(Silkworm feces extract,SFE)作為臨床藥物生血寧片的原料藥,是由葉綠素衍生物鐵和葉綠酸鈉組成的一種水溶性鐵絡合物。研究表明,鐵葉綠酸鈉是一種血紅素類似物,具有一定的抗貧血、抗炎、抗氧化等生物活性。本論文以蠶砂提取物為研究對象,體內建立缺鐵性貧血大鼠和急性炎癥小鼠模型,體外分別建立IL-6、BMP6和LPS誘導Hep G2細胞hepcidin高表達的細胞模型,并用蠶砂提取物對模型動物灌胃或與細胞共培養(yǎng),通過一系列方法研究蠶砂提取物對缺鐵性貧血和急性炎癥的防治效果及作用機制,重點探討了蠶砂提取物對hepcidin表達抑制作用及具體機制,為蠶砂提取物的臨床應用提供理論依據。第一部分蠶砂提取物抑制缺鐵性貧血大鼠hepcidin表達的作用及機制研究本部分研究采用低鐵飼料持續(xù)喂養(yǎng)大鼠并定期眼眶內眥放血,同時灌胃蠶砂提取物溶液(27 mg/kg和54 mg/kg),每周監(jiān)測血清鐵和血常規(guī)。4周后,全自動血液分析儀檢測血常規(guī)指標,蠶砂提取物組大鼠的Hb、RBC、HCT、MCV、MCH和MCHC較模型組顯著升高,RDW-CV較模型組顯著降低;原子吸收法檢測血清鐵和組織鐵,蠶砂提取物組血清鐵和組織鐵較模型組均顯著上升;試劑盒檢測TIBC,蠶砂提取物顯著降低了大鼠血清TIBC,升高了血清TSAT,表明蠶砂提取物能有效改善缺鐵性貧血。為了明確蠶砂提取物對hepcidin表達是否有抑制作用,ELISA檢測血清hepcidin,western blot檢測hepcidin和ferroportin1蛋白,結果表明蠶砂提取物顯著下調hepcidin的表達,上調ferroportin1的表達。進一步western blot檢測hepcidin上游相關蛋白和IRP/IRE通路中相關蛋白,RIP實驗檢測IRP與IRE的親和力,結果發(fā)現蠶砂提取物可下調p-JAK2、p-STAT3、BMP6、p-SMAD1/5/8、SMAD4和p38 MAPK的表達,從而抑制hepcidin的表達;且蠶砂提取物可激活IRP/IRE通路,上調IRP1、IRP2的表達,增強IRPs與IRE的親和力,從而上調Tf R1的表達,下調ferritin-L的表達,從而促進組織鐵釋放。綜上所述,蠶砂提取物不僅可以作為鐵劑補充鐵供應,還可以抑制hepcidin表達和激活IRP/IRE通路,促進組織鐵的釋放,有效改善缺鐵性貧血。本部分的研究為缺鐵性貧血的治療提供新思路,也為蠶砂提取物的臨床應用提供了一定的理論依據。第二部分蠶砂提取物抑制急性炎癥小鼠hepcidin表達的作用及機制研究本部分實驗我們先給小鼠灌胃蠶砂提取物(50 mg/kg)溶液6周,然后腹腔注射脂多糖(LPS,2μg/g)誘導急性炎癥。觀察肝臟組織HE染色切片,模型組細胞間界限不清,炎性細胞浸潤嚴重,而蠶砂提取物組細胞形態(tài)和炎性細胞浸潤程度均明顯改善;試劑盒檢測血清SOD活力和MDA含量,模型組小鼠血清SOD活力無明顯變化,MDA含量迅速升高,而蠶砂提取物組小鼠血清SOD活力顯著增加,MDA含量較模型組顯著降低。采用western blot檢測hepcidin和相關蛋白,蠶砂提取物組hepcidin、NF-κB和p-STAT3蛋白水平較模型組均顯著下降。綜上所述,蠶砂提取物能有效緩解LPS誘導的急性炎癥和氧化損傷,且蠶砂提取物能有效抑制LPS誘導的hepcidin高表達和炎性通路激活。本部分的研究為蠶砂提取物的臨床應用提供了新的方向。第三部分蠶砂提取物體外抑制hepcidin表達的研究為了進一步明確蠶砂提取物抑制hepcidin表達的作用機制,我們體外構建IL-6、BMP6和LPS誘導Hep G2細胞hepcidin高表達的模型。在給予或不給予蠶砂提取物(200μg/m L)溶液共培養(yǎng)的情況下,分別用IL-6(50 ng/m L)、BMP6(25 ng/m L)或LPS(1μg/m L)刺激Hep G2細胞。Western blot和q RT-PC檢測分析相關蛋白和hepcidin m RNA的表達情況。結果表明,IL-6刺激后,hepcidin m RNA、p-STAT3和p-JAK2的表達顯著升高,而蠶砂提取物共培養(yǎng)組明顯逆轉了IL-6的誘導作用;BMP6刺激后,hepcidin m RNA、p-SMAD1/5/8和SMAD4的表達顯著升高,而蠶砂提取物干預后明顯抵消了BMP6的誘導作用;LPS顯著上調了hepcidin、NF-κB和p-STAT3的蛋白水平,而蠶砂提取物組共培養(yǎng)后明顯抑制了LPS的誘導效果。總而言之,體外實驗進一步驗證蠶砂提取物能抑制JAK2/STAT3和BMP6/SMAD通路,下調hepcidin的表達。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1-1 蠶砂提取物改善缺鐵性貧血實驗流程圖Figure 1-1 The experimental design of SFE improving IDA

圖 1-2 蠶砂提取物對大鼠血清鐵的影響（n=8）Figure 1-2 Effects of SFE on serum iron contents in rats（n=8）C），模型組（IDA），陽性對照組（RhEPO），蠶砂提取物低劑劑量組（HSFE）；與正常組相比#P<0.05，##P<0.01; 與模型組

圖 1-3 蠶砂提取物對大鼠肝臟鐵的影響（n=8）Figure 1-3 Effects of SFE on liver iron contents in rats（n=8）C），模型組（IDA），陽性對照組（RhEPO），蠶砂提取物低劑劑量組（HSFE）；與正常組相比#P<0.05，##P<0.01; 與模型組

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本文編號：2769767