發(fā)布時間：2020-07-25 07:17

【摘要】：目的:藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是新藥創(chuàng)制的源頭。課題組設(shè)計合成中藥有效成分杜鵑素新結(jié)構(gòu)衍生物(DJS-F,DJS-2Cl,DJS-NO2),其血管內(nèi)皮細胞保護作用均明顯優(yōu)于先導(dǎo)物杜鵑素,但作用機制尚不明確。本文擬首先以人血清白蛋白(HSA)為模型蛋白,聯(lián)用藥物親和蛋白穩(wěn)定性篩選(DARTS)-光譜法-分子對接技術(shù)初步探討此類化合物與生物大分子作用特性及強度差異,探索一種體外考察活性化合物作用親和蛋白的有效方法;進而采用中空纖維細胞捕獲-高效液相色譜法(HFCF-HPLC)-DARTS/SDS-PAGE/MALDI-TOF聯(lián)用技術(shù),初步考察杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物在血管內(nèi)皮細胞中的親和蛋白,為后續(xù)明確此類化合物作用靶蛋白、指導(dǎo)進一步結(jié)構(gòu)修飾和改造提供實驗基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。方法:(1)DARTS-光譜法-分子對接聯(lián)用技術(shù)考察比較杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物與HSA的結(jié)合特性及差異:將供試化合物與HSA室溫孵育1 h,鏈酶蛋白酶裂解30 min,加入5×上樣緩沖液(5×Loading Buffer),95℃煮沸5 min,SDS-PAGE分離,考馬斯亮藍染色,分析HSA條帶,比較杜鵑素活性小分子與HSA作用條帶強度的差異;熒光光譜法比較其結(jié)合常數(shù);計算熱力學(xué)參數(shù)確定化合物與HSA結(jié)合的作用力類型;采用三維熒光光譜和圓二色譜技術(shù)研究此類化合物對HSA二級結(jié)構(gòu)的影響;利用分子對接技術(shù)預(yù)測并評價杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物與HSA相互作用模式。(2)HFCF-HPLC技術(shù):體外培養(yǎng)EA.hy926細胞,以中空纖維為載體,利用完整細胞、細胞膜和細胞器,分別與杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物孵育,HPLC法檢測,計算細胞不同部位對杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物的捕獲因子,對其親和蛋白進行初步定位;(3)DARTS/SDS-PAGE/MALDI-TOF-MS聯(lián)用技術(shù):提取EA.hy926細胞胞漿蛋白、質(zhì)膜蛋白,分別與杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物室溫孵育,鏈酶蛋白酶裂解,SDS-PAGE分離,MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定以及數(shù)據(jù)庫檢索,初步研究杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物在EA.hy926細胞的親和蛋白。結(jié)果:(1)DARTS/SDS-PAGE實驗:隨著DJS濃度逐漸增大,HSA條帶逐漸加深;同樣濃度的杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物DJS-F、DJS-2Cl、DJS-NO2作用的HSA條帶均較先導(dǎo)物DJS作用條帶深;熒光光譜分析:DJS、DJS-F、DJS-2Cl、DJS-NO2與HSA結(jié)合常數(shù)分別為4.01×105 mol·L-1、4.39×105 mol·L-1、8.83×105 mol·L-1、4.91×105 mol·L-1,結(jié)合位點數(shù)均為1;熱力學(xué)參數(shù)可知,該類化合物與HSA間的相互作用力主要為疏水作用力與氫鍵作用力;三維熒光光譜顯示杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物的加入使得HSA的峰A和峰B的熒光強度都呈現(xiàn)明顯下降并發(fā)生紅移;圓二色譜實驗:杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物的加入導(dǎo)致α-螺旋的含量出現(xiàn)下降趨勢。(2)DJS,DJS-F,DJS-2Cl,DJS-NO2的細胞捕獲因子(1.20、3.28、1.56、3.66)及細胞膜捕獲因子(1.15、4.43、3.57、2.31)均大于1;而細胞器捕獲因子(0.94、0.28、0.74、0.78)均小于1。(3)DARTS/SDS-PAGE-Western blot檢出杜鵑素新結(jié)構(gòu)衍生物在胞漿中的親和蛋白GRP78,且親和性強弱與內(nèi)皮細胞保護活性趨勢基本一致;DARTS/SDS-PAGE-MALDI-TOF-MS-Western blot檢出杜鵑素新結(jié)構(gòu)衍生物在膜蛋白中親和蛋白之一埃茲蛋白。結(jié)論:(1)以HSA為模型蛋白,DARTS-光譜法-分子對接聯(lián)用技術(shù)可作為一種體外考察活性化合物作用親和蛋白的有效方法;(2)杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物與HSA結(jié)合特性相似,但親和強度明顯高于其先導(dǎo)物杜鵑素;(3)HFCF-HPLC結(jié)果顯示杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物與內(nèi)皮細胞及細胞膜的親和性明顯高于先導(dǎo)物杜鵑素,親和性強弱與內(nèi)皮細胞保護活性趨勢一致,提示杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物作用親和蛋白可能定位于細胞膜中或者胞漿中的生物大分子;(4)杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物在內(nèi)皮細胞中的親和蛋白埃茲蛋白及GRP78的發(fā)現(xiàn)為明確此類化合物靶蛋白、指導(dǎo)進一步結(jié)構(gòu)修飾和改造奠定了實驗基礎(chǔ),提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

痰、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[8-11]。組前期研究發(fā)現(xiàn) DJS 具有良好的血管內(nèi)皮保護作用，JS-2Cl, DJS-NO2)活性明顯高于該先導(dǎo)物[12-14]，結(jié)構(gòu)式見用機制及作用靶點尚不清楚，限制了其結(jié)構(gòu)改造及其，明確此類藥物與生物大分子結(jié)合特性并探尋藥物作用的重點[15-21]。清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是人血漿中含量體液中 HSA 可運輸和儲存多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[22-2穩(wěn)定且廉價易得，已有文獻報道杜鵑素與 HSA 具有一定 可作為研究此類化合物與生物大分子結(jié)合特性的模式結(jié)構(gòu)衍生物同 HSA 相互作用的差異對于進一步研究此子的相互作用具有重要的指導(dǎo)意義。

比較杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍生物與 HSA 的考察DS-PAGE-考染脫色后，掃描凝膠。HSA 分子量66 左右的位置出現(xiàn)肉眼可見的 HSA 差異條帶。蛋白條帶顏色明顯深于溶劑對照組(DMSO)，表與 HSA 結(jié)合從而增強 HSA 蛋白酶抗性，保護 四種化合物 DJS，DJS-F，DJS-2Cl，DJS-NO2作帶均深于空白組，表明四種杜鵑素新結(jié)構(gòu)活性衍合。由圖 1-1 也可看出各衍生物組與蛋白孵育后生物 DJS-F，DJS-2Cl，DJS-NO2與 HSA 結(jié)合力

1-2 不同濃度的 DJS 與 HSA 相互作用 DARTS-SDS-PAGE 結(jié)果-2 Results of interaction between DJS with different concentration aDART-SDS-PAGE assay (n=3)度影響結(jié)果S-SDS-PAGE-考染脫色后，掃描凝膠，如圖 1-3 所示，加，HSA 條帶變淺；在不同的酶濃度的作用下，給藥相應(yīng)的溶劑對照組，表明 DARTS 技術(shù)可以用來檢測 D。1-3 給予不同濃度的鏈霉蛋白酶時 DARTS-SDS-PAGE 結(jié)果 (n

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳樹強;董國強;盛春泉;張萬年;;活性小分子化合物靶點驗證方法的研究進展[J];藥學(xué)實踐雜志;2016年02期

2 江濤;馬良;張宇昊;王佳曼;;光譜法研究黃曲霉毒素B_1與人血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)[J];分析化學(xué);2016年01期

3 屠鵬飛;曾克武;廖理曦;宋小敏;;天然活性小分子靶標(biāo)蛋白識別方法學(xué)研究進展[J];中國中藥雜志;2016年01期

4 董露;易忠勝;伍智蔚;王海洋;張愛茜;;2'-羥基-2,4-二溴二苯醚與人血清白蛋白作用機制的光譜研究與計算模擬[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2015年03期

5 李利華;薛雪;彭超;白小紅;;中空纖維脂質(zhì)體微篩選及其用于中藥中香豆素類和木脂素類可透膜成分群的篩選和捕獲[J];分析化學(xué);2013年03期

6 程凡升;張茂秋;程凡杰;生吉萍;陳婧雨;鄭鄢燕;申琳;;結(jié)構(gòu)預(yù)測及分子對接方法研究幾種水解產(chǎn)物對新阿魏酸酯酶的抑制作用[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2012年08期

7 王琳;張國文;付鵬;;維生素C、維生素B_2和葡萄糖對杜鵑素與BSA結(jié)合的擾動[J];分析試驗室;2011年09期

8 楊紅芹;李學(xué)軍;;化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)與藥物靶點的發(fā)現(xiàn)[J];藥學(xué)學(xué)報;2011年08期

9 ;Synthesis of New Flavanone Derivatives of Farrerol and Preliminary SAR Studies on Anti-VSMCs Vegetation Activity[J];Chemical Research in Chinese Universities;2011年02期

10 朱榮鑫;張賽龍;金永生;;黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2010年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 胡永勝;基于生物技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的雷公藤紅素及其類似物抗癌機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

本文編號：2769498