【摘要】：泌尿系結(jié)石是一種世界范圍的常見(jiàn)病、多發(fā)病,我國(guó)已經(jīng)成為世界上三大泌尿系結(jié)石高發(fā)區(qū)之一,其中腎結(jié)石為我國(guó)泌尿系結(jié)石發(fā)病率最高的疾病,80%以上的腎結(jié)石屬于草酸鈣結(jié)石。目前腎結(jié)石中藥療法因?yàn)槠錈o(wú)創(chuàng)傷、療效顯著、復(fù)發(fā)率小等明顯優(yōu)勢(shì),在臨床上被越來(lái)越多的患者所接受。但是中藥的用法用量是根據(jù)古代經(jīng)典著作和長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)所得,缺乏系統(tǒng)、科學(xué)的分析,所以對(duì)防治腎結(jié)石中藥的研究是十分必要的。廣金錢(qián)草(Herba Desmodii Styracifolii)為豆科植物廣金錢(qián)草Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分,是中國(guó)傳統(tǒng)中藥之一,具有抗炎、退熱、利尿通淋等作用,臨床上主要用于泌尿結(jié)石的治療。廣金錢(qián)草含有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、酚酸類(lèi)和生物堿類(lèi)等化學(xué)成分,其中黃酮類(lèi)化合物是其主要的藥理活性成分。雖有文獻(xiàn)報(bào)道廣金錢(qián)草有抗氧化作用,對(duì)大鼠有明顯的利尿作用和腎保護(hù)作用,可抑制腎結(jié)石的形成,但是其抗腎結(jié)石的機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步的研究。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù),對(duì)廣金錢(qián)草中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行定性分析,為其進(jìn)一步的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。建立同時(shí)測(cè)定尿液中草酸和檸檬酸濃度的高效液相色譜法和同時(shí)測(cè)定大鼠尿液和血清中多種化學(xué)元素含量的電感耦合等離子體質(zhì)譜法,為廣金錢(qián)草抗腎結(jié)石作用的藥效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究提供方法。通過(guò)灌胃給予廣金錢(qián)草提取液,觀察其對(duì)腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠尿液和血清相關(guān)指標(biāo)的影響及腎草酸鈣結(jié)晶的形成情況,初步探討廣金錢(qián)草抗腎結(jié)石的藥效及作用機(jī)制。第一部分液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)鑒定廣金錢(qián)草中51種黃酮類(lèi)化合物目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分離鑒定廣金錢(qián)草中多個(gè)黃酮類(lèi)化合物。方法:色譜柱為Agilent SB-C_(18)(100 mm×2.1 mm,2.7μm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸溶液,梯度洗脫,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量為2μL;電噴霧離子源,負(fù)離子模式檢測(cè)。首先把廣金錢(qián)草中已知的23種黃酮類(lèi)化合物的對(duì)照品溶液針泵進(jìn)樣到質(zhì)譜儀,進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描,通過(guò)對(duì)離子碎片的解析,總結(jié)裂解規(guī)律;廣金錢(qián)草提取物經(jīng)液相分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析,聯(lián)合采用數(shù)據(jù)處理軟件Peakview 1.2中的“IDA Explore”和“MasterView”功能,根據(jù)已知化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律和未知化合物的碎片信息對(duì)廣金錢(qián)草中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果:鑒定出了廣金錢(qián)草中的51個(gè)黃酮類(lèi)化合物,其中包括4個(gè)黃酮苷元,26個(gè)黃酮碳苷,5個(gè)黃酮氧苷,3個(gè)黃酮醇苷元,3個(gè)黃酮醇氧苷,2個(gè)二氫黃酮苷元,1個(gè)二氫黃酮氧苷,1個(gè)異黃酮苷元,2個(gè)異黃酮氧苷和4個(gè)二氫異黃酮。其中23個(gè)化合物通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比確證了結(jié)構(gòu),其余28個(gè)化合物則通過(guò)質(zhì)譜碎片信息推斷出了可能的結(jié)構(gòu),誤差范圍在±5 ppm之間。結(jié)論:本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法對(duì)廣金錢(qián)草中多個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,為其進(jìn)一步的藥效物質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠尿液中草酸和檸檬酸濃度目的:建立同時(shí)測(cè)定大鼠尿液中草酸和檸檬酸濃度的高效液相色譜法。方法:采用Cosmosil PBr色譜柱(250×4.6 mm,5μm),以0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.01 mol/L四丁基硫酸氫銨、2.69×10~-55 mol/L EDTA)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。大鼠尿液采用磺基水楊酸法沉淀蛋白。結(jié)果:尿液中草酸和檸檬酸的峰面積與濃度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。草酸和檸檬酸批內(nèi)與批間精密度的RSD范圍分別為3.7%~7.8%和3.2%~5.1%,RE均在±15%內(nèi)。兩者平均提取回收率為85.9%~91.6%,RSD均小于8.3%。結(jié)論:本文建立的HPLC法,靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便快速,為廣金錢(qián)草的抗腎結(jié)石機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。第三部分ICP-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)多種元素濃度目的:建立電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法同時(shí)測(cè)定大鼠尿液和血清中多種元素的含量。方法:樣品處理方法為直接稀釋法,采用2%的硝酸把尿液和血清樣品分別稀釋10倍和20倍,用前搖勻。ICP-MS工作參數(shù):射頻功率:1500 W,反射功率:2 W,載氣流速:1.1 L/min,等離子氣流速:15 L/min,泵速:0.3 r/min,霧化室溫度:2°C,校準(zhǔn)方式為內(nèi)標(biāo)法。結(jié)果:尿液和血清樣品中18種待測(cè)元素濃度與比率在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.99,檢測(cè)限、定量限、儀器精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均符合要求,尿液和血清中待測(cè)元素的加樣回收率范圍分別為99.1%~104.1%和93.1%~114.3%,RSD小于15%。結(jié)論:該法靈敏度高、重現(xiàn)性好,能快速準(zhǔn)確的同時(shí)測(cè)定尿液和血清中多種元素的含量,通過(guò)比較不同情況下大鼠體內(nèi)各元素含量變化,可為廣金錢(qián)草抗腎結(jié)石作用的藥效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。第四部分廣金錢(qián)草抗大鼠腎草酸鈣結(jié)石作用的研究目的:研究廣金錢(qián)草對(duì)大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:采用1%乙二醇和2%氯化銨誘導(dǎo)的腎草酸鈣結(jié)石大鼠模型進(jìn)行研究,大鼠隨機(jī)分為為4組(n=8):空白組(自由飲水)、成石組(1%乙二醇和2%氯化銨)、廣金錢(qián)草小劑量組和廣金錢(qián)草大劑量組(1%乙二醇和2%氯化銨+不同劑量的廣金錢(qián)草提取物),飼養(yǎng)28天后,收集各組大鼠的尿液和血清,對(duì)尿液中24 h尿草酸和檸檬酸含量和尿液、血清中多種化學(xué)元素濃度進(jìn)行檢測(cè),并用顯微鏡觀察尿涂片和腎組織切片中草酸鈣結(jié)晶及腎小管擴(kuò)張情況。結(jié)果:與成石組相比,廣金錢(qián)草小劑量和大劑量組尿草酸含量顯著降低(P0.05),而檸檬酸含量顯著升高(P0.05),尿液中Mg、Fe和Mo濃度升高(P0.05),Ca、Cu等化學(xué)元素濃度降低(P0.05)。與成石組相比,廣金錢(qián)草大劑量組血清中As濃度升高(P0.05),Pb濃度降低(P0.05)。而四組大鼠血清中其余元素濃度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。顯微觀察結(jié)果表明,廣金錢(qián)草能減少腎結(jié)石大鼠尿液及腎組織中草酸鈣結(jié)晶,緩解腎小管擴(kuò)張。結(jié)論:廣金錢(qián)草對(duì)腎草酸鈣結(jié)石形成有抑制作用,可能通過(guò)降低尿草酸含量以及影響尿液中鈣、鎂等化學(xué)元素含量來(lái)抑制結(jié)晶在腎中的沉積,從而發(fā)揮抑制腎草酸鈣結(jié)石的作用,并通過(guò)利尿作用促進(jìn)結(jié)石的排出。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R284.1;R285.5
【圖文】：

黃酮O-苷（a）和黃酮C-苷（b）類(lèi)碎片離子的命名lature adopted for various saccharide pdes (a) and C-Glycosides (b) in negati

28圖 2 木犀草素的二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律Fig. 2 The MS/MS spectrum and fragmentation pathway of luteolin

29圖 3 牡荊素的二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律Fig. 3 The MS/MS spectrum and fragmentation pathway of vitexin

【參考文獻(xiàn)】

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