【摘要】：目的:本課題以雌性C57BL/6小鼠為對(duì)象,應(yīng)用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides,MOG_(35-55))對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型進(jìn)行制備,運(yùn)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯(Buyang Huanwu decoction,BYHWD)灌胃進(jìn)行干預(yù),觀察對(duì)照組和治療組的臨床癥狀、病理變化及BYHWD對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脊髓、外周免疫系統(tǒng)脾臟單核巨噬細(xì)胞的影響。探討B(tài)YHWD治療EAE的有效性及對(duì)單核巨噬細(xì)胞免疫調(diào)控的作用及機(jī)制。方法:雌性C57BL/6小鼠42只,用小鼠MOG_(35-55)多肽免疫制備成EAE的模型,按照隨機(jī)數(shù)字分配表將小鼠分為EAE對(duì)照組、BYHWD治療組,每個(gè)組各有21只動(dòng)物。在免疫后的第3天開(kāi)始進(jìn)行灌胃給藥,EAE對(duì)照組予以自來(lái)水、BYHWD治療組給予BYHWD,500μl/只/d(含原藥1g),持續(xù)觀察臨床癥狀和體重變化。免疫后17天(p.i.17)各組統(tǒng)一處死9只動(dòng)物,無(wú)菌分離脾臟,5只用于制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞混懸液,流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry,FCM)檢測(cè)脾臟單核巨噬細(xì)胞M1型和M2型細(xì)胞亞型;4只脾臟經(jīng)脫水后制成冰凍切片進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色,檢測(cè)iNOS、Arginase-1的表達(dá)。脊髓冰凍切片進(jìn)行HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,羅氏染色觀察脊髓髓鞘脫失比例,免疫熒光組織化學(xué)染色、Western blot法檢測(cè)脊髓巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、Arginase-1及IL-10的表達(dá)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Graphpad Prism 6.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。結(jié)果:1.C57BL/6小鼠由MOG_(35-55)抗原乳劑免疫誘導(dǎo)后EAE小鼠模型成功建立。從平均起病時(shí)間來(lái)看,BYHWD組較EAE對(duì)照組而言,起病時(shí)間明顯推遲,臨床癥狀評(píng)分明顯降低;同時(shí),BYHWD治療組可明顯抑制EAE小鼠在發(fā)病期間的體重減輕(p0.01)。2.BYHWD治療后可減輕EAE小鼠脊髓的髓鞘脫失程度(p0.05)。3.HE染色和免疫熒光組織化學(xué)染色觀察到EAE脊髓有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。BYHWD可以減輕CNS CD68~+單核巨噬細(xì)胞及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(p0.05)。4.EAE小鼠經(jīng)BYHWD治療后,可顯著抑制脊髓及脾組織中巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、CD16/32的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)Arg-1、IL-10、CD206的表達(dá)(p0.05)。結(jié)論:1.BYHWD對(duì)EAE具有較好的治療效果,可以延緩EAE的發(fā)病程度,減輕EAE小鼠精神萎靡、食欲不振、四肢痿弱甚至癱瘓等中醫(yī)“痿癥”的臨床癥狀。2.BYHWD可減輕EAE髓鞘脫失,抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn),促進(jìn)髓鞘再生。3.BYHWD促進(jìn)EAE脊髓及脾組織中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型。其療效機(jī)制可能與其抗炎、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

15圖 3 BYHWD 抑制 EAE 小鼠脊髓組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（注：A 中 1 表示脊髓的后角，2 表示脊髓白質(zhì)外側(cè)區(qū)；應(yīng)用 Image-Pro 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Mean SD， n=4，* p<0.05 vs EAE group）2.4 BYHWD 促進(jìn) EAE 脊髓組織中 M1 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 M2 型根據(jù)表型及分泌細(xì)胞因子功能的不同，可將巨噬細(xì)胞分為 M1 型、M2 型。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎因子，促進(jìn)炎癥進(jìn)一步發(fā)展；M2 型巨噬細(xì)胞則通過(guò)修復(fù)組織使炎性反應(yīng)降低。本課題選取 iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 為代表進(jìn)行研究，熒

山西中醫(yī)藥大學(xué) 2017 屆碩士學(xué)位論文光顯微鏡下觀察到，在炎癥反應(yīng)嚴(yán)重的 EAE 組脊髓白質(zhì)區(qū)可見(jiàn) iNOS、TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)較多，成大片點(diǎn)狀分布；BYHWD 組分布少，僅有零星陽(yáng)性浸潤(rùn)（p<0.05）。Arg-1、IL-10 的表達(dá)則與 iNOS、TNF-α 相反，與 EAE 對(duì)照組相比，在 BYHWD 治療組的陽(yáng)性分布比較多而密集，兩組比較差異明顯(p<0.05)（圖 4A）。同時(shí)將脊髓蛋白用Western 印跡法檢測(cè)，譜帶及統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與治療組相比，iNOS、TNF-α在 EAE 對(duì)照組脊髓蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量高，Arg-1、IL-10 在 EAE 對(duì)照組脊髓蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低(p<0.05)（圖 4B）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2768793