【摘要】：目的土木香總內(nèi)酯是中藥土木香的有效成分,具有抗菌、驅(qū)蟲(chóng)、保肝等藥理作用,在中醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛。但目前缺乏對(duì)于土木香總內(nèi)酯的系統(tǒng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)資料。本研究通過(guò)觀察土木香總內(nèi)酯對(duì)胃黏膜有無(wú)損傷作用,探討損傷作用的發(fā)生機(jī)制,并比較土木香總內(nèi)酯停藥前后胃黏膜損傷的變化,為土木香這一中藥資源的合理應(yīng)用提供毒理學(xué)依據(jù)。方法試驗(yàn)選取6周齡SPF級(jí)SD大鼠150只,雌雄各半,隨機(jī)分為5組,分別以生理鹽水、溶媒CMC-Na與20mg/kg、120mg/kg、600mg/kg的土木香總內(nèi)酯灌胃。試驗(yàn)動(dòng)物于灌胃后28天每組雌雄各處死10只,其余5只動(dòng)物停止給藥進(jìn)入恢復(fù)期繼續(xù)飼養(yǎng)28天,而后處死取出全胃進(jìn)行大體觀察、HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)診斷;利用TUNEL方法檢測(cè)胃黏膜組織細(xì)胞凋亡情況;利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TNF-α TNFR1、TRADD、CK14、caspase 8在前胃黏膜的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件,大體解剖發(fā)現(xiàn)和組織學(xué)所見(jiàn)數(shù)據(jù)使用Fisher's確切概率法;TUNEL使用方差分析,免疫組織化學(xué)染色結(jié)果使用Fisher's確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。認(rèn)為P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.土木香總內(nèi)酯能誘導(dǎo)大鼠前胃病變。解剖可見(jiàn)給藥期大鼠對(duì)照組、溶媒組、土木香總內(nèi)酯20 mg/kg組前胃黏膜外觀正常,120mg/kg、600mg/kg組出現(xiàn)前胃黏膜蒼白、增厚、大小不等的結(jié)節(jié)。恢復(fù)期結(jié)束后所有胃黏膜恢復(fù)正常。鏡下可見(jiàn)對(duì)照組、溶媒組、20 mg/kg組大鼠前胃黏膜未見(jiàn)異常,120 mg/kg組大鼠前胃可見(jiàn)過(guò)角化,鱗狀上皮單純性增生與乳頭狀增生,在黏膜層中觀察到炎細(xì)胞浸潤(rùn),在黏膜下層發(fā)生不同程度的充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。600 mg/kg組除上述病變外,還可觀察到鱗狀上皮乳頭瘤樣增生�；謴�(fù)期末各組大鼠胃黏膜基本正常。說(shuō)明土木香總內(nèi)酯對(duì)SD大鼠具有毒性作用,靶器官在前胃,能誘發(fā)前胃黏膜炎癥與增生性病變。2.前胃黏膜病變與土木香總內(nèi)酯給藥劑量之間的關(guān)系:給藥期結(jié)束后,120mg/kg.組大鼠前胃黏膜損傷中,70%的大鼠前胃黏膜層發(fā)生過(guò)度角化;60%的大鼠前胃黏膜.發(fā)生增生性病變;60%大鼠前胃黏膜發(fā)生充血,40%發(fā)生水腫。這些病變的發(fā)生率均高于對(duì)照組、溶媒組與20 mg/kg組(P0.05)。600mg/kg組大鼠的前胃黏膜損傷中,100%的大鼠前胃黏膜發(fā)生了增生性病變,其中50%發(fā)生了鱗狀上皮乳頭瘤樣增生,明顯高于120mg/kg組;黏膜下層充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)與黏膜層充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)的發(fā)生率也明顯高于120mg/kg組(P0.05)。恢復(fù)期大鼠前胃黏膜均未見(jiàn)異常。說(shuō)明本試驗(yàn)中土木香總內(nèi)酯的未觀察到毒作用劑量(NOAEL)為20mg/kg,此劑量不引起大鼠前胃黏膜病變,而最低觀察到毒作用劑量(LOAEL)為120mg/kg。病變嚴(yán)重程度與土木香總內(nèi)酯存在劑量依賴關(guān)系。停藥后病變可恢復(fù)。3.土木香總內(nèi)酯誘導(dǎo)的增生性病變中凋亡指數(shù)的變化:給藥期大鼠正常前胃黏膜平均凋亡指數(shù)為23.61%;單純性增生為20.99%;乳頭狀增生18.63%,乳頭瘤樣增生為11.77%,與正常前胃黏膜(23.61%)相比顯著下降(P0.01);說(shuō)明土木香總內(nèi)酯誘導(dǎo)的前胃增生性病變中凋亡指數(shù)隨增生嚴(yán)重程度增加而降低。4.通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)各組SD大鼠正常前胃黏膜與各增生性病變中TNF-αTNFR1、TRADD、CK14與caspase 8的表達(dá)水平:TNF-α的高表達(dá)率隨著病變嚴(yán)重程度從正常胃黏膜(0%)、鱗狀上皮單純性增生(18%)、鱗狀上皮乳頭狀增生(45%)到鱗狀上皮乳頭瘤樣增生(73%)發(fā)展而逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TNR1的高表達(dá)率在正常胃黏膜(0%)、鱗狀上皮單純性增生(9%)、鱗狀上皮乳頭狀增生(36%)、鱗狀上皮乳頭瘤樣增生(73%),隨著增生發(fā)展而逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TRADD的高表達(dá)率在正常胃黏膜(0%)、鱗狀上皮單純性增生(1 8%)、鱗狀上皮乳頭狀增生(36%)、鱗狀上皮乳頭瘤樣增生(64%),隨著增生程度發(fā)展而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CK14的高表達(dá)率在正常胃黏膜(0%)、鱗狀上皮單純性增生(55%)、鱗狀上皮乳頭狀增生(82%)、鱗狀上皮乳頭瘤樣增生(91%),隨著增生程度發(fā)展而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而Caspase 8的陽(yáng)性表達(dá)率在正常胃黏膜(100%)、鱗狀上皮單純性增生(55%)、鱗狀上皮乳頭狀增生(36%)、鱗狀上皮乳頭瘤樣增生(9%),隨著增生程度發(fā)展而下降,趨勢(shì)與TUNEL結(jié)果相符,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)5.通過(guò)觀察正常組織與鱗狀上皮乳頭瘤樣增生中TRADD、CK14的表達(dá)定位的差異,發(fā)現(xiàn)土木香總內(nèi)酯誘發(fā)的鱗狀上皮乳頭瘤樣增生中TRADD與CK14呈共表達(dá)。結(jié)論土木香總內(nèi)酯對(duì)SD大鼠具有毒性作用,毒性作用的靶器官在前胃,可誘發(fā)前胃的炎癥及增生性病變。本試驗(yàn)中土木香總內(nèi)酯一般毒性效應(yīng)的未觀察到毒作用劑量(NOAEL)為20mg/kg,超過(guò)臨床最高用藥劑量6倍。而最低觀察到毒作用劑量(LOAEL)為120mg/kg。其對(duì)前胃的毒性損傷作用具有可逆性,停藥后病變可恢復(fù)。土木香總內(nèi)酯對(duì)于前胃鱗狀上皮增生性病變的誘導(dǎo)可能與TNFa-TNFRl-TRADD-FADD-caspase 8途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路有關(guān),其機(jī)制可能是使CK14與TRADD的解離減少,從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制TNF-α-TNFR1與TRADD形成復(fù)合體,阻止凋亡信號(hào)向下傳導(dǎo),減少下游蛋白caspase8的激活,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致鱗狀上皮乳頭瘤樣增生的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

三、增生性病變中大鼠前胃組織凋亡情況逡逑報(bào)物；ＨＥ診斷結(jié)果，我們對(duì)發(fā)屮在土木香總內(nèi)醋誘發(fā)的淲狀丨？．皮增屮性病變中的逡逑凋亡情況進(jìn)行丫邋ＴＵＮＥＬ檢測(cè)，并分析凋亡指數(shù)，與正常前胃黏膜進(jìn)行比較。與正常逡逑ｎ黏膜相比，增生忡病變屮的ｔｕｎｅｌ邋ｍ性細(xì)胞個(gè)數(shù)少，分布分散，尤以淲狀上皮乳逡逑頭瘤樣增牛：中明顯（閣５）。逡逑

相比具有顯著差異（／＞＜０．０0；鱗狀上皮乳頭瘤樣增叱的ｆ均凋亡指數(shù)為１１．７７％，與逡逑正常前胃黏膜、單純性增生、乳頭狀增生相比均有顯著差異（Ｐ＜0．（）ｌ）。而單純性增生逡逑與乳頭狀增生凋亡指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)表８、圖６）。逡逑表８各組大鼠正常前胃黏膜與增生性病變中凋亡指數(shù)（ＡＩ）的比較逡逑ｍ＼邐ｍ．邐狗ｒ：指數(shù)（％）逡逑正常前胃黏膜邐２０邐２３．６１邋士邋１．６６逡逑單純性增生邐丨丨邐２０．９９士２．２４‘逡逑乳頭狀增生邐１１邐１８．６３邋士邋３．３７’逡逑鱗狀上皮乳頭瘤樣增生邐１１邐１１．７７±２．３７＊＾逡逑注：＊：邋Ｐ＜０．０１，與正常前胃黏膜比較；＃：邋ＰＣ０．０Ｉ，與單純性增生比較；Ａ：逡逑Ｐ＜０．０１，Ｕ乳頭狀增生比較。逡逑２５逡逑

圖７免疫樷織化學(xué)法觀察給藥期火鼠止常前ｎ黏膜１邋ｊ增生性病變屮ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＲｌ、ＴＲＡＤ１４邋與邋ｃａｓｐａｓｅ８邋表達(dá)情況（４０0ｘ）逡逑９給藥期人鼠前Ｎ增屮性病變屮屮ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＫＩ、ＴＲＡＩ〕［）、ＣＫＩ４與ｃａｓｐａｓｅ８的高表達(dá)率逡逑ＴＮＩ－ａ邐ＴｎＦｒＩ邐Ｉ邋ＲＡＤＤ邐ＣＫＩ４邐ｃａｓｐａｓｅ邋前邋ｍ邋黏膜邐２０邐０％邐（０／２０）邐０％邐（０／２０）邐０％邐（０／２０）邐０％邐（０／２０）邐１００％邐（２０／２上皮中純忡增邋１：邐丨丨邐１８％邐（２／１邋１）邐９％邐（１／１１）邐１８％邐（２／１１邋）邐５５％邐（６／１１）邐＇邐５５％邋（６／１１）邋Ｉ－皮乳頭狀增卞邐ＩＩ邐４５％邐（５／１１）邋＊邐３６％邐（４／１邐１）邐＊邐３６％邐（４／１１）邋＊邐８２％邐（９／１１）邐＃邐３６％邋（４／１１邋）邋Ｉ．皮乳頭瘤樣增，Ｉ邐Ｉ邋１邐７３％邋（８／１１）邐７３％邋（８／１１）６４％邋（７／１１）邋９１％邋（邋１０／１１邋）邋＃邋９％邋（１／１１）逡逑注：ＰＣ０．０５，與正常胃黏膜相比；Ｐ＜０．０５，與鱗狀上皮單純性增生相比。逡逑２９逡逑

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本文編號(hào)：2768748