【摘要】：目的:黃芪多糖是黃中藥材黃芪的重要生物活性成分,具有增強免疫力、抵抗疾病、增強體質、改善心功能、抗氧化、抗病毒和抗癌癥等多種功能。臨床實踐發(fā)現(xiàn),黃芪可以促進創(chuàng)傷愈合,但其作用機制尚未見報道。本文研究黃芪多糖促進皮膚創(chuàng)面愈合的作用及促進皮膚創(chuàng)面修復的作用機制。方法:第一部分:黃芪多糖的提取、純化和黃芪多糖軟膏的制備。中藥材黃芪通過脫脂、水提、醇沉、脫蛋白得到粗的黃芪多糖(Astragalus polysaccharin,APS),粗黃芪多糖APS經過DEAE-Cellulose陰離子交換層析和Sephadex G-100分子篩層析得到黃芪多糖APS2-1。采用紫外和紅外光譜學分析鑒定黃芪多糖APS2-1的純度和特征吸收峰。黃芪多糖軟膏的配方為APS2-1㑳凡士林㑳SDS㑳水=2㑳60㑳2㑳65。第二部分:APS2-1促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的研究。建立小鼠皮膚切除傷口實驗動物模型,將小鼠分為APS2-1組、陰性對照組和陽性對照組,APS2-1組小鼠皮膚創(chuàng)面給予0.5g黃芪多糖軟膏,陰性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面給予0.5g不含黃芪多糖的凡士林軟膏(PBS:凡士林:SDS:水=2:60:2:65),陽性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面給予0.5g京萬紅軟膏。每天給藥1次,連續(xù)給藥3周。觀察小鼠狀態(tài)和體重、創(chuàng)面愈合情況、創(chuàng)面組織病理學變化,采用ELISA法檢測創(chuàng)面組織中TGF-β1、FGF-2、EGF和Cyclin D1的表達變化。第三部分:APS2-1對成纖維細胞的影響及其作用機制的研究。MTT法測定APS2-1對成纖維細胞CCC-HSF-1增殖的影響,Transwell法檢測APS2-1對成纖維細胞CCC-HSF-1遷移的影響,流式細胞分析術檢測APS2-1對成纖維細胞CCC-HSF-1細胞周期的影響,qRT-PCR法檢測APS2-1對成纖維細胞CCC-HSF-1的Cyclin D1的mRNA轉錄水平的影響,免疫印跡法檢測APS2-1對成纖維細胞CCC-HSF-1的信號通路調控蛋白NF-κB p65、IκBα和細胞周期調控蛋白Cyclin D1表達水平的影響。結果:黃芪多糖的提取、純化和黃芪多糖軟膏的制備。中藥材黃芪通過脫脂、水提、醇沉、脫蛋白、透析和凍干得到粗黃芪多糖APS。粗黃芪多糖APS經過DEAE-Cellulose陰離子交換柱分離純化后被分離成兩個峰,其中APS-2為酸性多糖且含量更高。APS-2經過Sephadex G-100分子篩分離純化后被分離成兩個峰,其中APS2-1分子量更大且相對含量更高。APS2-1紅外光譜分析顯示在4000-400cm~(-1)的波長范圍內,于3390、2930、1640、1420、1160、1010、914、760 cm~(-1)等處有明顯的吸收峰。APS2-1紫外光譜分析結果顯示280nm和254nm未出現(xiàn)吸收峰,說明APS2-1中不含蛋白質、多肽、核酸成分。APS2-1促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的研究結果顯示:給藥第7、14、21天APS2-1組小鼠體重顯著高于陰性對照組小鼠,APS2-1組和陽性對照組小鼠體重無顯著差異。給藥第7、14、21天APS2-1組小鼠創(chuàng)面愈合率顯著高于陰性對照組小鼠,APS2-1組和陽性對照組小鼠創(chuàng)面愈合率無顯著差異。APS2-1組小鼠皮膚創(chuàng)面組織病理學圖片顯示有少量的炎性細胞浸潤,出現(xiàn)了一些纖維母細胞,并且有一些新的血管和新的皮膚形成。陰性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面組織病理學圖片顯示創(chuàng)面組織中出現(xiàn)了大量的炎性細胞浸潤,未觀察到新的皮膚和新的血管形成。陽性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面組織病理學圖片顯示創(chuàng)面組織有少量的炎性細胞浸潤,有一些新的血管和新的皮膚形成。APS2-1組小鼠創(chuàng)面組織中細胞因子TGF-β1、FGF-2、EGF和細胞周期調控蛋白Cyclin D1的表達均顯著高于陰性對照組小鼠,APS2-1組和陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織中細胞因子TGF-β1、FGF-2、EGF和細胞周期調控蛋白Cyclin D1的表達水平無顯著差異。APS2-1對成纖維細胞的影響及其作用機制的研究結果顯示:倒置顯微鏡下成纖維細胞CCC-HSF-1呈現(xiàn)梭形、放射形、三角形、多角形,未貼壁的細胞呈現(xiàn)圓形。在0-48小時內生長緩慢屬于潛伏期。48-96小時內增長速率很快呈現(xiàn)指數(shù)增長屬于細胞增殖的對數(shù)期。96-144小時內細胞的生長速率又降低進入細胞生長的平臺期。1.0mg/l、5.0mg/l和25.0mg/l的APS2-1作用24、48、72h均能促進CCC-HSF-1增殖,最佳的作用濃度為25.0mg/l,最佳的作用時間為48小時。25.0mg/l黃芪多糖APS2-1呈時間依賴性促進CCC-HSF-1遷移。25.0mg/l的APS2-1能促進CCC-HSF-1向分裂期轉變。25.0mg/l的APS2-1能上調CCC-HSF-1的Cyclin D1 mRNA的轉錄和Cyclin D1蛋白的表達,但下調信號通路調控蛋白NF-κB p65和IκBα的表達。結論:1.本研究建立了黃芪多糖提取和純化的方法,并且建立了黃芪多糖紫外和紅外光譜學鑒定的方法。2.APS2-1促進表皮和真皮增生、促進血管再生,加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合。3.APS2-1促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的機制包括促進成纖維細胞增殖、遷移、細胞周期向分裂期轉變、上調TGF-β1、FGF-2、EGF和細胞周期調控蛋白Cyclin D1mRNA轉錄和蛋白表達、下調信號通路調控蛋白NF-κB p65和IκBα的表達。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

Fig 5 The photos of skin wounds in mice圖 5 小鼠皮膚創(chuàng)面照片2.4.2.2 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合率三組小鼠在創(chuàng)傷后 7 天、14 天和 21 天皮膚創(chuàng)面愈合率詳細見表 2 所給藥第 7 天 APS2-1 組小鼠平均創(chuàng)面愈合率為 23.58%，陰性對照組小為 17.08%，陽性對照組小鼠平均創(chuàng)面愈合率為 24.87%。APS2-1 組小鼠于陰性對照組小鼠創(chuàng)面愈合率（P＜0.001），說明黃芪多糖 APS2-1 連續(xù)小鼠皮膚創(chuàng)面的愈合。APS2-1 組小鼠和陽性對照組小鼠創(chuàng)面愈合率無顯說明黃芪多糖 APS2-1 與京萬紅軟膏連續(xù)給藥 7 天在促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈果。給藥第 14 天 APS2-1 組小鼠平均創(chuàng)面愈合率為 59.68%，陰性對照組率為 43.59%，陽性對照組小鼠平均創(chuàng)面愈合率為 60.51%。APS2-1 組小

蘭州大學博士研究生學位論文 黃芪多糖促進皮膚傷口愈合的作用及其相關機制的APS2-1 組和陰性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面組織病理學圖片比較顯示 APS2-1 組比陰性組小鼠創(chuàng)面組織中的炎性細胞浸潤時間更早發(fā)生，創(chuàng)傷后第 14 天既有纖維母細胞出現(xiàn)新的皮膚和新的血管出現(xiàn)的時間更加早。以上多項結果說明說明黃芪多糖 APS2-1 趨化母細胞、促進表皮再生、促進血管再生。APS2-1 組和陽性對照組小鼠皮膚創(chuàng)面組織病圖片比較顯示兩組小鼠創(chuàng)面組織中的炎性細胞均在創(chuàng)傷后第 7 天有了大量浸潤，新的皮血管形成的時間均在創(chuàng)傷后第 14 天觀察到，說明黃芪多糖 APS2-1 和京萬紅軟膏在促皮膚和新血管形成方面具有相似的效果。但創(chuàng)傷后第 14 天窗面組織病理學顯示實驗組性對照組多了纖維母細胞，說明黃芪多糖 APS2-1 對于纖維母細胞的趨化作用更強。

蘭州大學博士研究生學位論文 黃芪多糖促進皮膚傷3.4 結果3.4.1 成纖維細胞 CCC-HSF-1 的形態(tài)觀察和生長曲線倒置顯微鏡下觀察成纖維細胞 CCC-HSF-1 呈現(xiàn)梭形、放壁的細胞呈現(xiàn)圓形。顯微鏡下成纖維細胞 CCC-HSF-1 的形CCC-HSF-1 的生長曲線見圖 9 所示，從生長曲線可以觀察到成小時內生長緩慢，屬于潛伏期。48-96 小時內增長速率很快呈對數(shù)期。96-144 小時內細胞的生長速率又降低進入細胞生長的細胞進行實驗。

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本文編號：2768967