發(fā)布時間：2020-07-24 09:55

【摘要】：目的:從中醫(yī)理論上探討AD與老年失眠共同病因病機(jī)及相關(guān)性,進(jìn)一步結(jié)合《內(nèi)經(jīng)》時間醫(yī)學(xué)理論探討安神益智法擇時給藥的合理性。通過動物實(shí)驗(yàn)觀察安神益智法擇時給藥對AD小鼠認(rèn)知及節(jié)律基因的影響以驗(yàn)證其有效性。為進(jìn)一步闡明AD與失眠兩者關(guān)系及安神益智法作用機(jī)制,使用GO富集分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接與動力學(xué)模擬等方法對兩者關(guān)聯(lián)基因、酸棗仁湯作用靶點(diǎn)、γ-氨基丁酸受體和乙酰膽堿酯酶做相關(guān)研究。方法:1.查閱AD與老年失眠相關(guān)中醫(yī)文獻(xiàn),探討兩者共同病因病機(jī)。整理中醫(yī)時間醫(yī)學(xué)關(guān)于子午流注及營衛(wèi)理論的研究,再結(jié)合擇時給藥相關(guān)文獻(xiàn)探討安神益智法擇時給藥的合理性。2.將90只小鼠分為空白組、模型組、安神組、益智組、早安神晚益智組、早益智晚安神組。使用D-半乳糖腹腔注射和左側(cè)腦室注射Aβ_(1-42)制造復(fù)合型AD模型小鼠。給藥組小鼠分7:00和19:00兩個時間點(diǎn)給藥,給藥持續(xù)3周,灌胃給藥安神方為酸棗仁湯,益智方為益智溫膽顆粒。使用Morris水迷宮對各組小鼠進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)來檢測各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。使用熒光定量Pcr法檢測下丘腦Per1、Bmall、Clock晝夜節(jié)律基因和海馬IDE基因表達(dá)水平。使用ELISA法檢測海馬IDE蛋白水平。3.在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索AD與失眠有關(guān)基因,篩選出兩者之間的重復(fù)基因建立AD與失眠關(guān)聯(lián)基因數(shù)據(jù)庫。使用Cluego對關(guān)聯(lián)基因作GO生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析得出對兩個疾病均有重要影響的信號通路,從而在信號通路層面上闡述兩者之間的相關(guān)性。4.對酸棗仁湯有效成份中作用于AD與失眠關(guān)聯(lián)基因的靶點(diǎn)作GO生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析,從而探索酸棗仁湯改善AD與失眠的共同作用機(jī)制。5.為進(jìn)一步闡明酸棗仁湯改善AD與失眠的作用機(jī)制,選取GABA受體和AchE兩個靶蛋白結(jié)構(gòu),使用分子對接和分子動力學(xué)模擬的方法對作用于兩個靶點(diǎn)的成份進(jìn)行半柔性對接和動力學(xué)模擬,以在微觀層面上探索有效成份小分子與靶蛋白之間的相互作用結(jié)構(gòu)及結(jié)合后的穩(wěn)定性。結(jié)果:1.理論研究表明AD與老年失眠共同病機(jī)主要為腎虛與痰濁,其中以腎虛為主。根據(jù)子午流注理論與營衛(wèi)理論提出的安神益智法擇時給藥治療AD有一定的理論基礎(chǔ)。2.動物實(shí)驗(yàn)中Morris水迷宮結(jié)果表明與空白組比較,AD模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降(P0.05);與AD模型組比較,給藥組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有不同程度提高(P0.05,P0.01),其中以早安神晚益智組提高最為明顯(P0.01)。RT-PCR結(jié)果表明相對于空白組,模型組Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA表達(dá)均下調(diào),IDE mRNA表達(dá)上調(diào)。與模型組比較,給藥組小鼠Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA、IDE mRNA表達(dá)均上調(diào),早安神晚益智組IDE mRNA上調(diào)最為明顯。海馬組織IDE ELISA結(jié)果與PCR趨勢一致,與空白組比較,其余各組小鼠海馬組織內(nèi)IDE含量明顯升高(P0.05),早安神晚益智組IDE含量最高(P0.01)。3.AD與失眠關(guān)聯(lián)基因富集分析結(jié)果表明兩者之間的在生物過程方面的聯(lián)系主要集中在神經(jīng)肽信號通路、神經(jīng)沖動傳遞、突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、髓細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等,在KEGG信號通路方面的聯(lián)系主要集中在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、胰島素分泌、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路中。4.酸棗仁湯對于AD與失眠關(guān)聯(lián)基因富集分析顯示其作用機(jī)制在生物過程方面主要集中在類固醇分解過程、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)生物合成過程、凝血調(diào)節(jié)、纖維蛋白溶解的調(diào)節(jié),在KEGG信號通路方面的聯(lián)系主要集中在補(bǔ)體和凝血級聯(lián)信號通路、血清素能突觸、類固醇激素生物合成等信號通路中。5.GABA受體對接結(jié)果顯示最優(yōu)配體是MOL005018,AchE對接結(jié)果顯示最優(yōu)配體是MOL004966。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示MOL005018和MOL004966均能與對應(yīng)的受體穩(wěn)定結(jié)合。結(jié)論:1.AD與老年失眠共同病因病機(jī)主要為腎虛與痰濁,其中以腎虛為主。2.安神益智法中的早安神晚益智給藥對于復(fù)合型AD模型小鼠的認(rèn)知能力改善最佳。3.AD與失眠在多種生物過程和KEGG信號通路中密切相關(guān)。4.酸棗仁湯對AD和失眠共同作用機(jī)制是多方面的,主要集中在類固醇分解過程、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)生物合成過程、凝血調(diào)節(jié)、纖維蛋白溶解的調(diào)節(jié)、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)信號通路、血清素能突觸、類固醇激素生物合成等信號通路中。5.酸棗仁湯作用于GABA受體和AchE的有效成份有多種,主要可能為MOL005018和MOL004966小分子。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

與模型組比較，其它各組小鼠的上平臺潛伏期均縮短(P<0.01，P<0.05)，空白組、益智組、早安神晚益智組、早益智晚安神組游泳總路程均有縮短（P<0.01，P<0.05）。與早益智晚安神組比較，早安神晚益智組上平臺潛伏期縮短（P<0.05），游泳總路程減少(P<0.05)，益智組上平臺潛伏期縮短，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見下表。表 1-5 定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=15）組別 上平臺潛伏期（s） 游泳總路程（cm） 上臺前平均速度（cm/s）空白組 31.10±10.64** 365.49±75.36** 13.07±4.33模型組 61.10±24.66 735.83±143.24 13.04±3.69安神組 50.40±12.85* 816.86±118.13 15.13±4.34益智組 38.64±16.29** 403.39±95.21* 12.01±6.31早安神晚益智組 35.63±7.46**# 318.54±90.55**# 10.41±5.11早益智晚安神組 40.75±12.89* 342.89±78.18** 11.12±6.08與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01。與早益智晚安神組比較，#p<0.05。

安神益智法擇時給藥對 AD 模型小鼠認(rèn)知與節(jié)律基因影響及作用機(jī)制分析表 1-6 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=15）組別 穿平臺次數(shù) 目標(biāo)象限時間（s）空白組 6.37±2.74** 44.61±12.47*模型組 1.56±0.62 22.37±7.74安神組 3.45±0.27* 30.02±12.34*益智組 5.72±1.37**# 44.19±12.58*早安神晚益智組 6.02±1.04**#▲ 46.69±15.18*早益智晚安神組 4.08±1.15** 45.56±11.63*與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01。與早益智晚安神組比較，#p<0.05。與益智組比較，▲p<0.05。

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文△Ct 3.15±0.59 2.35±0.28 2.86±0.32 智組 -△△Ct -0.73 -1.26 -0.82 2-△△Ct0.60 0.42 0.57 △Ct 3.03±0.47 2.71±0.27 2.85±0.87 神組 -△△Ct -0.61 -0.81 -0.82 2-△△Ct0.66 0.57 0.57 A 檢測海馬組織 IDE 蛋白含量白組比較，其余各組小鼠海馬組織內(nèi) IDE 含量明顯升。與早益智晚安神組比較，早安神晚益智組 IDE），安神組升高，但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05

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