【摘要】：目的:從中醫(yī)理論上探討AD與老年失眠共同病因病機及相關性,進一步結合《內經》時間醫(yī)學理論探討安神益智法擇時給藥的合理性。通過動物實驗觀察安神益智法擇時給藥對AD小鼠認知及節(jié)律基因的影響以驗證其有效性。為進一步闡明AD與失眠兩者關系及安神益智法作用機制,使用GO富集分析、網絡藥理學、分子對接與動力學模擬等方法對兩者關聯(lián)基因、酸棗仁湯作用靶點、γ-氨基丁酸受體和乙酰膽堿酯酶做相關研究。方法:1.查閱AD與老年失眠相關中醫(yī)文獻,探討兩者共同病因病機。整理中醫(yī)時間醫(yī)學關于子午流注及營衛(wèi)理論的研究,再結合擇時給藥相關文獻探討安神益智法擇時給藥的合理性。2.將90只小鼠分為空白組、模型組、安神組、益智組、早安神晚益智組、早益智晚安神組。使用D-半乳糖腹腔注射和左側腦室注射Aβ_(1-42)制造復合型AD模型小鼠。給藥組小鼠分7:00和19:00兩個時間點給藥,給藥持續(xù)3周,灌胃給藥安神方為酸棗仁湯,益智方為益智溫膽顆粒。使用Morris水迷宮對各組小鼠進行定位巡航實驗和空間探索實驗來檢測各組小鼠空間學習記憶能力。使用熒光定量Pcr法檢測下丘腦Per1、Bmall、Clock晝夜節(jié)律基因和海馬IDE基因表達水平。使用ELISA法檢測海馬IDE蛋白水平。3.在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索AD與失眠有關基因,篩選出兩者之間的重復基因建立AD與失眠關聯(lián)基因數(shù)據(jù)庫。使用Cluego對關聯(lián)基因作GO生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析得出對兩個疾病均有重要影響的信號通路,從而在信號通路層面上闡述兩者之間的相關性。4.對酸棗仁湯有效成份中作用于AD與失眠關聯(lián)基因的靶點作GO生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析,從而探索酸棗仁湯改善AD與失眠的共同作用機制。5.為進一步闡明酸棗仁湯改善AD與失眠的作用機制,選取GABA受體和AchE兩個靶蛋白結構,使用分子對接和分子動力學模擬的方法對作用于兩個靶點的成份進行半柔性對接和動力學模擬,以在微觀層面上探索有效成份小分子與靶蛋白之間的相互作用結構及結合后的穩(wěn)定性。結果:1.理論研究表明AD與老年失眠共同病機主要為腎虛與痰濁,其中以腎虛為主。根據(jù)子午流注理論與營衛(wèi)理論提出的安神益智法擇時給藥治療AD有一定的理論基礎。2.動物實驗中Morris水迷宮結果表明與空白組比較,AD模型組小鼠學習記憶能力下降(P0.05);與AD模型組比較,給藥組小鼠學習記憶能力均有不同程度提高(P0.05,P0.01),其中以早安神晚益智組提高最為明顯(P0.01)。RT-PCR結果表明相對于空白組,模型組Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA表達均下調,IDE mRNA表達上調。與模型組比較,給藥組小鼠Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA、IDE mRNA表達均上調,早安神晚益智組IDE mRNA上調最為明顯。海馬組織IDE ELISA結果與PCR趨勢一致,與空白組比較,其余各組小鼠海馬組織內IDE含量明顯升高(P0.05),早安神晚益智組IDE含量最高(P0.01)。3.AD與失眠關聯(lián)基因富集分析結果表明兩者之間的在生物過程方面的聯(lián)系主要集中在神經肽信號通路、神經沖動傳遞、突觸后膜電位的調節(jié)、髓細胞凋亡、炎癥反應等,在KEGG信號通路方面的聯(lián)系主要集中在神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、胰島素分泌、細胞因子-細胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路中。4.酸棗仁湯對于AD與失眠關聯(lián)基因富集分析顯示其作用機制在生物過程方面主要集中在類固醇分解過程、多巴胺轉運、神經遞質生物合成過程、凝血調節(jié)、纖維蛋白溶解的調節(jié),在KEGG信號通路方面的聯(lián)系主要集中在補體和凝血級聯(lián)信號通路、血清素能突觸、類固醇激素生物合成等信號通路中。5.GABA受體對接結果顯示最優(yōu)配體是MOL005018,AchE對接結果顯示最優(yōu)配體是MOL004966。分子動力學模擬結果顯示MOL005018和MOL004966均能與對應的受體穩(wěn)定結合。結論:1.AD與老年失眠共同病因病機主要為腎虛與痰濁,其中以腎虛為主。2.安神益智法中的早安神晚益智給藥對于復合型AD模型小鼠的認知能力改善最佳。3.AD與失眠在多種生物過程和KEGG信號通路中密切相關。4.酸棗仁湯對AD和失眠共同作用機制是多方面的,主要集中在類固醇分解過程、多巴胺轉運、神經遞質生物合成過程、凝血調節(jié)、纖維蛋白溶解的調節(jié)、補體和凝血級聯(lián)信號通路、血清素能突觸、類固醇激素生物合成等信號通路中。5.酸棗仁湯作用于GABA受體和AchE的有效成份有多種,主要可能為MOL005018和MOL004966小分子。
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

與模型組比較，其它各組小鼠的上平臺潛伏期均縮短(P<0.01，P<0.05)，空白組、益智組、早安神晚益智組、早益智晚安神組游泳總路程均有縮短（P<0.01，P<0.05）。與早益智晚安神組比較，早安神晚益智組上平臺潛伏期縮短（P<0.05），游泳總路程減少(P<0.05)，益智組上平臺潛伏期縮短，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見下表。表 1-5 定位巡航實驗結果（x±s，n=15）組別 上平臺潛伏期（s） 游泳總路程（cm） 上臺前平均速度（cm/s）空白組 31.10±10.64** 365.49±75.36** 13.07±4.33模型組 61.10±24.66 735.83±143.24 13.04±3.69安神組 50.40±12.85* 816.86±118.13 15.13±4.34益智組 38.64±16.29** 403.39±95.21* 12.01±6.31早安神晚益智組 35.63±7.46**# 318.54±90.55**# 10.41±5.11早益智晚安神組 40.75±12.89* 342.89±78.18** 11.12±6.08與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01。與早益智晚安神組比較，#p<0.05。

安神益智法擇時給藥對 AD 模型小鼠認知與節(jié)律基因影響及作用機制分析表 1-6 空間探索實驗結果（x±s，n=15）組別 穿平臺次數(shù) 目標象限時間（s）空白組 6.37±2.74** 44.61±12.47*模型組 1.56±0.62 22.37±7.74安神組 3.45±0.27* 30.02±12.34*益智組 5.72±1.37**# 44.19±12.58*早安神晚益智組 6.02±1.04**#▲ 46.69±15.18*早益智晚安神組 4.08±1.15** 45.56±11.63*與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01。與早益智晚安神組比較，#p<0.05。與益智組比較，▲p<0.05。

湖北中醫(yī)藥大學 2019 屆碩士學位論文△Ct 3.15±0.59 2.35±0.28 2.86±0.32 智組 -△△Ct -0.73 -1.26 -0.82 2-△△Ct0.60 0.42 0.57 △Ct 3.03±0.47 2.71±0.27 2.85±0.87 神組 -△△Ct -0.61 -0.81 -0.82 2-△△Ct0.66 0.57 0.57 A 檢測海馬組織 IDE 蛋白含量白組比較，其余各組小鼠海馬組織內 IDE 含量明顯升。與早益智晚安神組比較，早安神晚益智組 IDE），安神組升高，但是差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05

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