【摘要】：目的:在前列腺癌的綜合治療過程中,中醫(yī)藥的地位日益顯著。在本研究中,我們立足于探索當歸貝母苦參丸對前列腺癌的治療機制,通過網(wǎng)絡藥理學方法分析復方中所包含的成分及其作用靶點,將藥物本身的作用靶點與前列腺癌疾病相關的靶點相匹配,尋找當歸貝母苦參丸作用于前列腺癌的的主要作用靶點和主要有效成分。隨后,選取該復方中主要的成分--槲皮素(Que)進行體外實驗驗證,證實前期的分析結果的有效性和準確性。方法:通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺檢索當歸貝母苦參丸中所包含的化學成分和作用靶點,通過Uni Prot KB網(wǎng)絡平臺以及Genecards數(shù)據(jù)庫獲取靶蛋白的基因名;使用Cytoscape軟件構建當歸貝母苦參丸的成分--靶點網(wǎng)絡圖。通過文獻查閱以及查詢CTD數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫的方式來獲取前列腺癌疾病相關的靶點,將前列腺癌疾病相關靶點與當歸貝母苦參丸作用靶點進行分子對接,在STRING數(shù)據(jù)庫中構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(PPI),在Cytoscape中進行網(wǎng)絡可視化分析。通過DAVID數(shù)據(jù)平臺對關鍵靶蛋白進行GO分析、KEGG富集通路分析,并對分析的結果進行總結和分類。根據(jù)網(wǎng)絡藥理學分析結果,選取網(wǎng)絡中的主要成分Que進行體外細胞學實驗進行驗證。首先培養(yǎng)前列腺癌PC3細胞,觀察加藥后不同濃度Que對前列腺癌細胞形態(tài)的影響、通過臺盼藍染色計數(shù)實驗觀察Que對前列腺癌細胞增殖的影響、通過Transwell實驗觀察Que對前列腺癌細胞遷移能力的影響、通過流式細胞儀檢測不同濃度Que對前列腺癌細胞凋亡的影響,最后通過Western-blot實驗檢測加藥后不同濃度Que對前列腺癌細胞內(nèi)與增殖和凋亡相關蛋白的影響。結果:1.網(wǎng)絡藥理學分析結果(1)從TCMSP中藥數(shù)據(jù)庫中篩選出該復方中的有效成分共含有255個,經(jīng)過OB值和DL值評估后得到26個有效成分,這26個有效成分共有246個作用靶點。(2)采用Cytoscape軟件構建當歸貝母苦參丸的成分--靶點網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡圖表明當歸貝母苦參丸中具有代表性的成分節(jié)點有槲皮素(MOL000098),木犀草素(MOL000006)等;而前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP 90)等則是該復方發(fā)揮作用的主要靶點。(3)當歸貝母苦參丸作用于前列腺癌的靶點共有135個,通過蛋白--蛋白互作網(wǎng)絡圖分析發(fā)現(xiàn)這些靶點之前的相互作用關系多達3066種。通過Cytoscape中的插件和算法分析出這135個靶點中的關鍵基因有34個。(4)通過GO分析和KEGG富集通路分析總結出當歸貝母苦參丸主要能夠通過促進細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制細胞遷移和侵襲以及抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮其抗腫瘤作用。2.體外實驗驗證結果:(1)Que對前列腺癌細胞增殖的影響:在加藥24h和48h后,加藥組的細胞數(shù)量與對照組相比明顯減少,并呈藥物劑量依賴性(P0.0001)。(2)Que對前列腺癌細胞凋亡的影響:隨著藥物濃度的不斷增高,前列腺癌PC3細胞的凋亡數(shù)目不斷增多,當濃度為150um時,Que的促凋亡作用最明顯,凋亡率為26.13±3.36%。(3)Que對前列腺癌細胞遷移的影響:加藥16h后統(tǒng)計穿出Transwell小室的細胞數(shù),發(fā)現(xiàn)Que能抑制PC3細胞的遷移能力,并呈藥物劑量依賴性(P0.005)。(4)Que對前列腺癌細胞中增殖和凋亡相關蛋白表達的影響:Que能夠明顯降低PC3細胞內(nèi)與增殖相關的蛋白p-AKT的表達;此外還降低了抑制細胞凋亡的蛋白Bcl-2的表達、升高了促凋亡蛋白BAX的表達。此外,Que還對分子伴侶蛋白HSP90具有一定的抑制作用。結論:1.經(jīng)網(wǎng)絡藥理學分析表明,中藥復方當歸貝母苦參丸中包含多種有效的抗癌成分,具體可能通過以下四種方式:抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制細胞的遷移和侵襲、抑制腫瘤血管生成。2.實驗驗證表明,復方中的主要成分Que能夠通過抑制前列腺癌PC3細胞的增殖、促進PC3細胞的凋亡、抑制PC3細胞的遷移來發(fā)揮其抑癌作用。該實驗驗證與前期網(wǎng)絡藥理學的分析結果部分相吻合。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

HSP 90)、自主神經(jīng)β2 腎上腺素受體(β-2 adrenergic receptor,ADR構酶Ⅱα(topoisomerase 2α，TOP2α)以及雄激素受體(androgen recep均與前列腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，說明這些靶點在當歸貝母列腺癌的過程中可能作為主要靶點被抑制來發(fā)揮作用。表 1 有效成分基本信息（Degree＞14）MOL ID 成分名稱 OB 值（％） MOL000098MOL000006MOL000392MOL000358MOL000449MOL003542MOL000456MOL003673MOL003648MOL006596MOL001484QuercetinLuteolinFormononetinbeta-sitosterolStigmasterol8-Isopentenyl-kaempferolPhaseolinWighteoneInerminGlyceollinInermine46.4336.1669.6736.9143.8338.0478.242.875.1897.2775.18

1.2.2 藥物疾病交集靶點的 PPI 網(wǎng)絡分析通過前期數(shù)據(jù)挖掘與分子對接，將獲得的藥物與疾病交集靶數(shù)據(jù)庫進行分析后，取評分≥0.9 的蛋白互作關系數(shù)據(jù)導入 Cytosc分析。如圖 1.2 所示，該 PPI 網(wǎng)絡共有 135 個節(jié)點，節(jié)點之前的相達 3066 種。通過 CytoHubba 插件中的 Degree、MCC、EPC、D網(wǎng)絡中的每個節(jié)點進行分析，取每種算法排名前 10 的靶點綜合鍵基因（如圖 1.3 所示），分別是 TP53、AKT1、IL6、TNF、MYCIL1B、HSP90AA1、MMP2、JUN、VEGFA、MAPK1、FOS、IL4、IL1A、IFNG、MMP9、、CYP1A1、CASP8、PRKCD、GSK3B、MMP1、BCL2。進一步通過 STRING 對這些關鍵靶點進行蛋白關度值最高的為 TP53，能與 33 個蛋白相關聯(lián)，其次還有 JUN 和 P與 32 和 31 個蛋白相關聯(lián)。所有的關鍵基因都在前列腺癌的發(fā)生演重要角色。

圖 1.3 關鍵靶點網(wǎng)絡互作圖1.2.3 當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的機制分析通過 DAVID 數(shù)據(jù)分析平臺對以上 PPI 網(wǎng)絡行 GO 富集分析以及 KEGG 富集分析，研究當能機制。在 GO 分析過程中，我們根據(jù)錯誤發(fā)共確定了 350 個條目（FDR＜0.05），其中生物表 2 列出了交集靶基因排名前 20 的生物功能條胞凋亡調(diào)控、細胞程序性死亡調(diào)控、細胞周期機物刺激反應等方面。在通路富集分析中，共得FDR 值＜0.05 的共有 20 條。如圖 1.4 所示，主Pathways in cancer）、前列腺癌信號通路（hsa0號通路（hsa05219：Bladder cancer）、胰腺癌

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本文編號：2768449