【摘要】：研究背景糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥中最常見的微血管并發(fā)癥,其在糖尿病患者中的發(fā)病率為20%~40%,已經(jīng)是導(dǎo)致終末期腎臟病最重要的單一因素。研究發(fā)現(xiàn),腎小球?yàn)V過屏障的改變,尤其是其中足細(xì)胞因?yàn)樽允墒艿降膿p傷在DN的病理變化中起到關(guān)鍵的作用。多項(xiàng)研究表明,AMPK,mTOR、p53、JNK、SIRT1等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控參與自噬,這些信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的改變,在糖尿病腎病發(fā)展中具有重要作用。基于以上研究,本項(xiàng)目以離體培養(yǎng)腎小球小鼠足細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象,運(yùn)用分子生物學(xué)方法研究祛風(fēng)補(bǔ)腎方調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用,以期發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)補(bǔ)腎方治療糖尿病腎病的分子機(jī)制。為了更好的模擬祛風(fēng)補(bǔ)腎方在機(jī)體內(nèi)的藥物作用,采用提取含藥動(dòng)物血清作為實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行研究。目的通過觀察祛風(fēng)補(bǔ)腎方對條件性永生足細(xì)胞生長及其AMPK-mTOR信號(hào)通路和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為祛風(fēng)補(bǔ)腎方改善糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.高糖高滲對足細(xì)胞生長及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響體外培養(yǎng)足細(xì)胞,MTT篩選高糖濃度及作用時(shí)間,實(shí)驗(yàn)分三組:正常組(5.6mmol/L葡萄糖)作為正常對照組、甘露醇組(5.6mmol/L葡萄糖+19.4mmol/L甘露醇)作為滲透壓對照組、高糖組(25mmol/L葡萄糖)。足細(xì)胞培養(yǎng)24h后,流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞凋亡情況,分析高糖高滲對細(xì)胞凋亡影響;Western Blot檢測各組細(xì)胞AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR、Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)情況。2.高糖下調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)通路對足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分五組:高糖組作為對照組,AMPK激動(dòng)劑組、mTOR抑制劑組、AMPK抑制劑組、AMPK激動(dòng)劑+mTOR抑制劑組,五組均在高糖條件下。體外培養(yǎng)條件性永生足細(xì)胞24h后,Western Blot檢測各組細(xì)胞Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)情況。3.祛風(fēng)補(bǔ)腎方對高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞生長及損傷的影響體外培養(yǎng)足細(xì)胞,MTT檢測不同含藥血清對足細(xì)胞生存率影響,選取兩組做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分四組:正常組,高糖組,祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量組,祛風(fēng)補(bǔ)腎方高劑量組。流式細(xì)胞儀檢測四組細(xì)胞的凋亡情況。透射電鏡下觀察各組細(xì)胞自噬體的形成,觀察各組自噬情況。4.祛風(fēng)補(bǔ)腎方對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分五組:正常組、高糖組、祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量組、祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量+AMPK抑制劑組、AMPK抑制劑組。體外培養(yǎng)足細(xì)胞24h后,Western Blot檢測各組細(xì)胞AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR、Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.MTT結(jié)果示,足細(xì)胞加藥24h,葡萄糖濃度在25mmol/L時(shí),高糖對足細(xì)胞損傷適中,模型穩(wěn)定;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示,正常組與甘露醇組凋亡率無顯著差別,高糖凋亡率明顯升高;Western Blot結(jié)果示:高糖組較正常組Beclin-1表達(dá)明顯升高,Nephrin、Podocin表達(dá)相對下降,P-AMPK/AMPK比值減少,P-mTOR/mTOR比值增加。甘露醇組與正常組比較無明顯區(qū)別。2.Western Blot結(jié)果示:AMPK激動(dòng)劑、mTOR抑制劑組及AMPK激動(dòng)劑+mTOR抑制劑組較高糖組Beclin-1、Nephrin、Podocin表達(dá)明顯升高,AMPK激動(dòng)劑+mTOR抑制劑組尤為顯著。AMPK抑制劑組較高糖組Beclin-1、Nephrin、Podocin表達(dá)相對下降。3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示,祛風(fēng)補(bǔ)腎方低、高劑量足細(xì)胞凋亡數(shù)目均較高糖組少,且低劑量優(yōu)于高劑量。透射電鏡結(jié)果示:高糖組細(xì)胞的自噬體比正常組有所增加,而祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量及高劑量的足細(xì)胞自噬體較高糖組均明顯增多。4.Western Blot結(jié)果示:祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量組較高糖組上調(diào)Beclin-1、Nephrin、Podocin、P-mTOR/mTOR表達(dá)相對升高,P-AMPK/AMPK表達(dá)相對下降;祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量+AMPK抑制劑組則較祛風(fēng)補(bǔ)腎方低劑量組Beclin-1、Nephrin、Podocin、P-mTOR/mTOR表達(dá)下降,P-AMPK/AMPK比值減少。結(jié)論1.足細(xì)胞在高糖刺激下可以產(chǎn)生自噬,且通過AMPK-mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)足細(xì)胞自噬,可以減輕足細(xì)胞的損傷。2.祛風(fēng)補(bǔ)腎方可以增強(qiáng)高糖下足細(xì)胞的自噬,減輕足細(xì)胞損傷。3.祛風(fēng)補(bǔ)腎方可能通過AMPK-mTOR信號(hào)通路,從而促進(jìn)足細(xì)胞自噬保護(hù)足細(xì)胞,改善高糖誘導(dǎo)下足細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 高糖及高滲狀態(tài)下對 足細(xì)胞生 長 及蛋白表達(dá)的影響1.1 高糖濃度的篩選MTT 結(jié) 果示，在所選取的 高糖濃 度中 ，高糖濃度為 25m時(shí)間為 24 小時(shí)對高糖誘導(dǎo)下的 足細(xì)胞殺傷力適中，模型相擇 25mmol/L 的高 糖刺 激 24 小時(shí) 的足 細(xì)胞 作為 足細(xì) 胞損 傷 模時(shí)間 48 小時(shí)，足細(xì)胞狀態(tài)不佳，模型不穩(wěn)定。

B 甘露醇組 高糖下滲透壓對足細(xì)胞形態(tài)的影響滲 狀下對足細(xì)胞凋亡的影響 胞 儀 檢 測 足 細(xì) 胞 體 外 培 養(yǎng) 24h 正 常 組亡 狀況 ， 結(jié)果 示： 正常 組 及 甘 露醇 組 無 顯 著 差 異 （ P>0.05） ， 但 是 高 糖 組 組 增 加 細(xì) 胞 凋 亡率 的 主 要 原因 ， 是 因是高糖時(shí)滲透壓改變。故高糖是 造成

A 正常組 B 甘露醇組 C 高糖組圖 2 高糖下滲透壓對足細(xì)胞形態(tài)的影響1.3 高糖高滲 狀下對足細(xì)胞凋亡的影響流 式 細(xì) 胞 儀 檢 測 足 細(xì) 胞 體 外 培 養(yǎng) 24h 正 常 組 、 甘 露 醇 組 及 高 糖 組 三組的細(xì)胞 凋亡 狀況 ， 結(jié)果 示： 正常 組 及 甘 露醇 組足 細(xì)胞 凋亡 細(xì)胞數(shù) 所占百 分 比 數(shù) 目 無 顯 著 差 異 （ P>0.05） ， 但 是 高 糖 組 顯 著 升 高 （ P<0.01） 。故 說 明 高糖 組 增 加 細(xì) 胞 凋 亡率 的 主 要 原因 ， 是 因 為高 糖 可 以引 起 足 細(xì) 胞凋亡，而不是高糖時(shí)滲透壓改變。故高糖是 造成足細(xì)胞損傷的主要原因 。

【參考文獻(xiàn)】

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