發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 22:48

【摘要】：背景及目的:化學(xué)療法是臨床腫瘤患者常用的治療手段,治療過程中產(chǎn)生的原發(fā)和繼發(fā)耐藥是腫瘤化療失敗的根本原因,克服耐藥是提高腫瘤化療效果的關(guān)鍵。據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)統(tǒng)計(jì),90%以上腫瘤患者死亡原因與腫瘤多藥耐藥(MDR)有關(guān),其中ATP結(jié)合盒(ATP binding casssette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)是引起MDR的主要原因。目前為止,還沒有耐藥逆轉(zhuǎn)劑被美批準(zhǔn)上市,從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒、專一性好的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。靈芝三萜B8組分是從靈芝中提取分離出來的活性物質(zhì),課題組發(fā)現(xiàn)B8在低劑量下有著良好的逆轉(zhuǎn)MDR耐藥活性。本文主要評(píng)價(jià)靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導(dǎo)的多藥耐藥活性作用及其機(jī)制研究。方法:(1)用MTT法測(cè)定非細(xì)胞毒濃度的靈芝三萜B8組分作用于ABCB1高表達(dá)的耐藥細(xì)胞株及對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞株對(duì)其底物藥物和非底物藥物的耐藥逆轉(zhuǎn)活性;(2)用RT-qPCR、Western Blot法分別檢測(cè)靈芝三萜B8組分對(duì)ABCB1基因的mRNA、P-gp蛋白表達(dá)數(shù)量變化影響;(3)通過流式細(xì)胞儀觀察靈芝三萜B8組分對(duì)羅丹明123、多柔比星的蓄積以及對(duì)多柔比星外排影響;(4)采用Pgp-Glo~TMM ATPase試劑盒體外檢測(cè)靈芝三萜B8組分對(duì)ABCB1 ATP酶活性的影響;(5)使用P450-Glo~TMM Screening System試劑盒體外檢測(cè)靈芝三萜B8組分對(duì)腫瘤藥物代謝肝藥酶CYP3A4活性的影響;(6)通過建立ICR小鼠肝癌H_(22)皮下移植瘤模型,觀察靈芝三萜B8組分對(duì)口服紫杉醇抗腫瘤作用的影響,探討靈芝三萜B8組分對(duì)腸黏膜P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響;(7)通過建立裸鼠KBv200皮下移植瘤模型,觀察靈芝三萜B8組分聯(lián)合長(zhǎng)春新堿對(duì)KBv200皮下移植瘤的抑制作用,探討靈芝三萜B8組分體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥的作用;(8)采用HPLC法觀察靈芝三萜B8組分處理組對(duì)抗癌藥物紫杉醇藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響作用。結(jié)果:(1)靈芝三萜B8組分作用于各高表達(dá)P-gp耐藥株相對(duì)于各親本細(xì)胞株的毒性較為不敏感;(2)非細(xì)胞毒濃度的靈芝三萜B8組分作用于高表達(dá)P-gp細(xì)胞株對(duì)于P-gp底物藥物多柔比星、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿有著逆轉(zhuǎn)耐藥的效果,并隨著靈芝三萜B8組分的劑量提高逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也隨之增加,然而對(duì)非P-gp底物藥物順鉑則無逆轉(zhuǎn)耐藥效果,同時(shí)對(duì)親本細(xì)胞株幾乎無增效作用;(3)靈芝三萜B8組分能顯著性增加對(duì)P-gp底物羅丹明123以及多柔比星的蓄積量;同時(shí)對(duì)多柔比星的外排功能起到抑制作用;(4)靈芝三萜B8組分對(duì)ABCB1基因mRNA、P-gp的表達(dá)數(shù)量上無差異變化;(5)靈芝三萜B8組分對(duì)腫瘤藥物代謝肝藥酶CYP3A4活性的抑制影響呈藥物梯度依賴性,靈芝三萜B8組分低濃度(2μg/mL)對(duì)代謝肝藥酶CYP3A4活性抑制程度較弱;(6)靈芝三萜B8組分對(duì)ABCB1 ATPase活性無顯著影響;(7)靈芝三萜B8組分可能通過抑制胃腸道黏膜P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能,有效增強(qiáng)口服紫杉醇對(duì)小鼠皮下H_(22)移植瘤的抗腫瘤作用;(8)長(zhǎng)春新堿(VCR)(0.5mg/kg)、B8(200mg/kg)、B8+VCR(200+0.5mg/kg)組對(duì)裸鼠KBv200皮下移植瘤的抑瘤率分別為23.12%、31.87%、59.85%。(9)通過口服靈芝三萜B8組分處理組與陰性組的比較,兩組的小鼠紫杉醇藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并無顯著性差異。結(jié)論:靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外能夠有效地逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導(dǎo)的耐藥作用。主要通過以下機(jī)制研究:(1)靈芝三萜B8組分抑制P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能;(2)靈芝三萜B8組分并不改變對(duì)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá);(3)靈芝三萜B8組分低濃度(2μg/mL)對(duì)代謝肝藥酶CYP3A4活性抑制作用較弱;(4)靈芝三萜B8組分對(duì)ABCB1 ATPase活性無影響變化;(5)靈芝三萜B8組分能夠可能通過抑制胃腸道黏膜P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能,提高口服紫杉醇的生物利用度,增強(qiáng)其抗H_(22)腫瘤作用;(6)靈芝三萜B8組分通過逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導(dǎo)的耐藥作用,提高長(zhǎng)春新堿對(duì)高表達(dá)P-gp的KBv200皮下移植瘤的抑制水平;(7)靈芝三萜B8組分對(duì)紫杉醇藥物的代謝動(dòng)力學(xué)不產(chǎn)生顯著影響;綜上研究表明了靈芝三萜B8組分在體內(nèi)外能夠有效地逆轉(zhuǎn)由ABCB1介導(dǎo)的耐藥作用,為分離出新型靈芝三萜單體化合物逆轉(zhuǎn)耐藥劑奠定良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

37(與CTL組相比較， **， P <0.01)圖1.2靈芝三萜B8組分作用于KBv200、KB細(xì)胞對(duì)多柔比星(A)以及羅丹明123(B)的蓄積情況Figure 1.2The effect of B8 on intracellular accumulation of DOX (A) and RH123 (B)inKBv200 and KB was measured by flow cytometric analysis, respectively.3.2 靈芝三萜 B8 抑制 ABCB1 介導(dǎo)的多柔比星外排將多柔比星與KBv200細(xì)胞共孵育3小時(shí)后，撤去多柔比星為阻斷其蓄積來源，

38（**，P<0.01）圖1. 3靈芝三萜B8組分作用于KBv200細(xì)胞對(duì)多柔比星的外排影響Figure 1.3 Effect of B8 on the efflux of DOX on KBv2003.3 靈芝三萜 B8 對(duì) KBv200 細(xì)胞 ABCB1 基因轉(zhuǎn)錄、翻譯水平無影3.3.1 對(duì)KBv200細(xì)胞ABCB1mRNA表達(dá)量無變化影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Tab1.4顯示，通過求得的mRNA相對(duì)表達(dá)量2^DDC較，各實(shí)驗(yàn)處理組的2^DDCt均在1之間，說明各實(shí)驗(yàn)組ABCB1基因在mRNA的水平上既不顯著上調(diào)也不顯著下調(diào)，并且各實(shí)驗(yàn)組之間對(duì)ABCB1基因在mRNA達(dá)上無明顯差異，因此可以得出，在不同作用時(shí)間以及不同濃度梯度下的靈芝

B8 50μg/mL 72h 1.098 0.867 0.895 0.953±0.126B8 100μg/mL 72h 0.966 1.185 0.940 1.030±0.134圖1.4 靈芝三萜B8組分對(duì)KBv200細(xì)胞ABCB1 mRNA表達(dá)的影響Figure 1.4 Effect of B8 on ABCB1 mRNAexpression in KBv200 cell.

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2767943