發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 23:13

【摘要】：目的:在C57BL/6小鼠原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元細(xì)胞研究MJS對(duì)組胺(Histamine,Hist)、血清素(5-hydroxytryptamine,5-HT)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)及氯喹(Chloroquine,Chlo)的抑制作用;在DRG神經(jīng)元細(xì)胞研究MJS對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)作用;在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T細(xì)胞研究MJS對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)作用。方法及結(jié)果:1.MJS在原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)元對(duì)Hist、5-HT、ET-1及Chlo的抑制作用快速分離、收集4-6周C57BL/6雄性小鼠L2-L6(Lumbar two-Lumbar six)DRG,培養(yǎng)16-18 h,在鈣成像系統(tǒng)(RC-26型放大器、MP-285型1550B數(shù)模轉(zhuǎn)換器、BT100-2J型顯微鏡及DG-4型離子成像光源),采用熒光探針Fura-2-A研究MJS對(duì)Hist、5-HT、ET-1及Chlo的抑制作用。Fura-2-AM胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè)結(jié)果顯示,20μM MJS對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯影響;100μM Hist、100μM 5-HT、100μM ET-1及100μM Chlo均可引起鈣離子濃度顯著升高;20μM MJS可明顯抑制100μM Hist、100μM5-HT、100μM ET-1及100μM Chlo所致鈣離子濃度的升高。2.不同TRP通道特異激動(dòng)劑對(duì)原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)元鈣離子濃度的影響及MJS的調(diào)節(jié)作用取分離、培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細(xì)胞,采用Fura-2-AM檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度,研究TRPV1特異激動(dòng)劑辣椒素(Capsaicin,Cap)、TRPV4特異激動(dòng)劑GSK1016790A(GSK101)及TRPA1特異激動(dòng)劑AITC對(duì)鈣離子濃度的影響及MJS的調(diào)節(jié)作用。Fura-2-AM鈣成像結(jié)果顯示,20μM MJS對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞中鈣離子濃度無明顯影響;1μM Cap、100 n M GSK101及100μM AITC均可引起鈣離子濃度顯著升高;20μM MJS可明顯抑制100 n M Cap和50 n M GSK101所致鈣離子濃度的升高;而對(duì)100μM AITC所致鈣離子濃度升高無明顯影響。3.不同TRP通道特異激動(dòng)劑對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白HEK293T細(xì)胞鈣離子濃度的影響及MJS的調(diào)節(jié)作用采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白,轉(zhuǎn)染試劑采用LIPOFECTAMINE 2000。以質(zhì)粒中RFP紅色蛋白為報(bào)告基因,轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)具有代表性視野的紅色熒光細(xì)胞,計(jì)算轉(zhuǎn)染率;采用免疫印跡法(Western blotting,WB)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Q-PCR)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果。采用Fura-2-AM觀察Cap、GSK101及AITC對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T細(xì)胞鈣離子濃度的影響及MJS的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)染TRP蛋白N端融合Red fluorescent protein(RFP)紅色熒光蛋白,熒光結(jié)果可見紅色熒光蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá),表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞并表達(dá),轉(zhuǎn)染率為60%以上;WB和Q-PCR結(jié)果分別檢測(cè)到陽性蛋白和m RNA的表達(dá),說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRP蛋白到HEK293T細(xì)胞成功并表達(dá)。Fura-2-AM鈣成像結(jié)果顯示,20μM MJS對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T細(xì)胞鈣離子濃度無明顯影響;100 n M Cap、50 n M GSK101及100μM AITC均可導(dǎo)致相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞鈣離子濃度顯著升高;20μM MJS可顯著抑制100 n M Cap和50 n M GSK101所致質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRPV1、TRPV4蛋白的HEK293T細(xì)胞鈣離子濃度的升高,對(duì)100μM AITC引起鈣離子濃度的升高無明顯影響。結(jié)論:MJS在原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)元對(duì)Hist、5-HT、ET-1和Chlo引起的興奮作用有顯著抑制;TRPV1、TRPV4及TRPA1通道參與DRG神經(jīng)元及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TRP蛋白的HEK293T細(xì)胞的興奮性,MJS能夠抑制TRPV1及TRPV4通道的激活,對(duì)TRPA1通道激活無影響。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

ANOVA）方差分析，結(jié)果均用 mean ± SEM 表示。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 C57BL/6 小鼠原代培養(yǎng) DRG 神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及細(xì)胞鑒定剛接種的細(xì)胞為圓形或者橢圓形，約 3 h 開始貼壁（A），接種 12 h 后大多數(shù)細(xì)胞開始貼壁，有的已經(jīng)長(zhǎng)出突起，2 天之后神經(jīng)元突起生長(zhǎng)迅速，形成樹突網(wǎng)（B）。7 天之后神經(jīng)元突起多而粗大，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞體呈現(xiàn)圓形或者橢圓形，胞體比較大，光暈強(qiáng)，細(xì)胞之間交織形成密集神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)、且突起細(xì)長(zhǎng)。細(xì)胞采用 NSE 免疫組化鑒定，NSE 在胞漿中表達(dá)，染色后陽性細(xì)胞呈深棕色，形態(tài)為圓形或者橢圓形，有的細(xì)胞可顯示突起伸出（C）。A B CA B C

A) Culture the cells for 1 hour（.光鏡×200）(B) Culture the cells for 24 hour（.(C) Expression of NSE protein in DRG neurons.（DAB×200）ist和 5-HT對(duì)原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子濃度影響及MJS的用 Fura-2AM 鈣成像技術(shù)，分別檢測(cè) Hist 和 5-HT 在原代培養(yǎng)的鈣離子濃度的變化，并研究 MJS 的調(diào)節(jié)作用。果如圖 2 所示，100 μM Hist 可致 DRG 神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子濃度；20 μM MJS 對(duì) DRG 細(xì)胞中鈣離子濃度無明顯影響（A）；抑制 100 μM Hist 所致鈣離子濃度的明顯升高（A），差異具有）（B）。00 μM 5-HT 可致 DRG 神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子濃度明顯升高（C）；G 細(xì)胞中鈣離子濃度無明顯影響（C）；20 μM MJS 可明顯抑制 10離子濃度的明顯升高（C），差異具有顯著性（P < 0.05）（D

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果如圖 3 所示，100 μM ET-1 可致 DRG 神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子濃度明顯升高（A）；20 μM MJS 對(duì) DRG 細(xì)胞中鈣離子濃度無明顯影響（A）；20 μM MJ可明顯抑制 100 μM ET-1 所致鈣離子濃度的明顯升高（A），差異具有顯著性（< 0.05）（B）。100 μM Chlo 可致 DRG 神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子濃度明顯升高（C）；20 μM MJ對(duì) DRG 細(xì)胞中鈣離子濃度無明顯影響（C）；20 μM MJS 可明顯抑制 100 μM Chl所致鈣離子濃度的明顯升高（C），差異具有顯著性（P < 0.05）（D）。

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本文編號(hào)：2767965