【摘要】：目的:本課題研究的目的是為了從不同配比的丹參-檀香藥對(duì)中篩選出抗心肌缺血再灌注損傷療效最好的組合,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究,為指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥和現(xiàn)代中藥新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。方法:1.以提取物得率為指標(biāo),利用單因素實(shí)驗(yàn)考察和響應(yīng)曲面優(yōu)化分別對(duì)丹參和檀香藥材的提取方法、藥材粉碎粒度、提取溶劑種類、提取溶劑濃度、料液比進(jìn)行篩選和優(yōu)化,并建立最優(yōu)的丹參和檀香藥材提取方案。2.采用手術(shù)法造大鼠左前降支結(jié)扎的心肌缺血再灌注模型,取70只大鼠,分為7組,每組10只,雌雄各半,分別代表假手術(shù)組、模型組、陽性對(duì)照組、給藥組1:丹參高劑量+檀香高劑量組(DGTG)、給藥組2:丹參高劑量+檀香低劑量組(DGTD)、給藥組3:丹參低劑量+檀香高劑量組(DDTG)、給藥組4:丹參低劑量+檀香低劑量組(DDTD),分別測定各組的心肌梗死面積,觀察HE染色的心肌組織病理變化,檢測血清中CK、LDH和心臟組織中SOD、GSH-Px的活力以及心臟組織中MDA的含量,并利用RT-PCR技術(shù)對(duì)心肌組織中Bcl-2和Bax基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測定,通過以上指標(biāo)來確定丹參-檀香藥對(duì)的最佳組合,并對(duì)其體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷作用的機(jī)理進(jìn)行初探。3.建立H9C2心肌細(xì)胞的缺氧缺糖/再灌注模型(OGD/R),分別提取大鼠給藥丹參提取物、檀香提取物和丹參-檀香混合提取物10天后的含藥血清,利用MTT法分別考察以上三組含藥血清的細(xì)胞毒性和對(duì)H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用,進(jìn)而通過結(jié)晶紫染色觀察不同給藥組的細(xì)胞形態(tài),通過Hochest 33258和EB/AO染色考察不同給藥組對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,通過JC-1染色考察不同給藥組對(duì)線粒體損傷的影響,為后續(xù)蛋白組學(xué)的研究提供趨勢和線索。4.運(yùn)用iTRAQ定量蛋白組學(xué)方法對(duì)空白對(duì)照組(DZ)、OGD/R模型組(MX)、丹參含藥血清組(FA1)、檀香含藥血清組(FA2)和丹參-檀香混合含藥血清組(FA3)的心肌細(xì)胞進(jìn)行蛋白組學(xué)研究,利用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組之間差異表達(dá)蛋白(P-value0.01,FC≥1.5)的功能進(jìn)行生物過程、細(xì)胞定位和分子功能的GO注釋分析,利用在線工具KAAS對(duì)差異表達(dá)蛋白(P-value0.01,FC≥1.5)的功能進(jìn)行注釋,并使用KEGG mapper繪制注釋蛋白的信號(hào)通路。通過分析關(guān)鍵差異蛋白的功能和信號(hào)通路信息,構(gòu)建丹參-檀香協(xié)同發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用網(wǎng)絡(luò);然后,利用Western blot技術(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的蛋白表達(dá)和磷酸化情況進(jìn)行驗(yàn)證,最終確定丹參-檀香配伍使用的作用機(jī)理。結(jié)果:1.丹參和檀香的最佳提取工藝分別為:丹參提取物最佳工藝(藥材粉碎粒度100目,乙醇濃度約為54%,料液比1:25)和檀香提取物最佳工藝(藥材粉碎粒度160目,乙醇濃度約為81%,料液比1:23)。2.心肌梗死面積測定結(jié)果顯示,與模型組相比,陽性對(duì)照組和給藥組1,2,和3均能顯著降低大鼠心肌梗死面積(P0.01),給藥組4雖然也能降低大鼠的心肌梗死面積(P0.05),但其作用效果明顯劣于其他三組;HE染色結(jié)果表明,丹參對(duì)心肌組織損傷的保護(hù)貢獻(xiàn)度較高,所有丹參高劑量組(給藥組1和2)的治療效果均好于丹參低劑量組(給藥組3和4);而檀香對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用也呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組。血清心肌酶測定結(jié)果表明,給藥組和陽性對(duì)照組均能顯著降低血清中CK和LDH的含量(P0.01),給藥組的作用效果與丹參和檀香提取物的加入量呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,總體來講,給藥組1的效果最好,其次為給藥組2、給藥組3和給藥組4;心臟組織氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)測定結(jié)果表明,陽性對(duì)照組和各給藥組的SOD含量均明顯升高(P0.01,P0.05);陽性對(duì)照組、給藥組1、2、3的GSH-Px的含量明顯升高(P0.01,P0.05),MDA的含量顯著降低(P0.01);而給藥組4僅對(duì)SOD的活力有顯著影響(P0.05),但對(duì)GSH-Px和MDA含量只有升高和降低的趨勢,與模型組相比,沒有顯著性差異。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給藥組1、2、3和陽性對(duì)照組均能顯著升高Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量(P0.01,P0.05),所有給藥組和陽性對(duì)照組均能顯著降低Bax的相對(duì)表達(dá)量(P0.01,P0.05),說明以上實(shí)驗(yàn)組均能不同程度的抑制心肌細(xì)胞凋亡,起到一定的保護(hù)心肌細(xì)胞作用;相對(duì)而言,給藥組1和給藥組2對(duì)Bcl-2和Bax的表達(dá)調(diào)控均極為顯著,是所有給藥組中保護(hù)心肌細(xì)胞作用效果最好的兩組。3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,丹參-檀香混合組(DTE)在5%濃度劑量時(shí)的保護(hù)作用最為顯著(P0.01),其次分別為丹參提取物組(DE)5%濃度劑量(P0.05)和檀香提取物組(TE)5%濃度劑量(P0.05);通過結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步證實(shí)了丹參-檀香合用要優(yōu)于拆方之后的單獨(dú)使用效果;Hochest 33258染色結(jié)果表明,DTE、DE和TE均能顯著降低凋亡細(xì)胞的數(shù)量(P0.01),其中作用效果強(qiáng)弱順序?yàn)镈TEDETE;EB/AO染色表明,DTE的凋亡細(xì)胞比例明顯下降(P0.01),染色質(zhì)形態(tài)也趨于正常,具有較好的心肌細(xì)胞保護(hù)作用;DE和TE與模型組相比,凋亡細(xì)胞的比例也有明顯的下降(P0.01),但TE的早期凋亡細(xì)胞(綠色斑點(diǎn))的比例要明顯高于DE,因此其心肌細(xì)胞凋亡抑制作用要相對(duì)較弱;JC-1染色結(jié)果表明,DTE、DE和TE均能顯著降低綠色熒光的比例(P0.01),其中DTE作用效果要優(yōu)于其他兩組,而DE和TE的作用效果相仿。4.GO功能注釋結(jié)果表明,經(jīng)過丹參含藥血清預(yù)處理后,心肌細(xì)胞外部空間和環(huán)境相關(guān)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、脂代謝、膽固醇代謝、甘油三酯代謝和細(xì)胞內(nèi)各種微粒的清除能力等均有不同程度的影響;檀香含藥血清除了對(duì)細(xì)胞外部空間和環(huán)境相關(guān)蛋白的表達(dá)影響,對(duì)ATP合成、氧結(jié)合與氧運(yùn)載能力等方面也有不同程度的改善;將丹參與檀香合用之后,對(duì)細(xì)胞的外部空間環(huán)境響應(yīng)、緊急情況應(yīng)激反應(yīng)、缺氧應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、機(jī)械刺激應(yīng)激反應(yīng)、線粒體ATP合成、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白合成、鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力等均有不同程度的影響,說明將二者結(jié)合使用,會(huì)產(chǎn)生更為廣泛的生物活性。KEGG功能注釋及信號(hào)通路分析結(jié)果表明,給藥丹參含藥血清之后,膠原粘附蛋白高表達(dá),激活下游PI3K-Akt信號(hào)通路,以產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的效果,同時(shí)溶酶體表達(dá)下調(diào),也佐證了損傷細(xì)胞器的減少,證明產(chǎn)生了一定的治療效果;檀香提取物含藥血清與丹參提取物含藥血清的作用通路相似,均與膠原粘附過程和PI3K/Akt通路相關(guān),同時(shí),檀香提取物含藥血清對(duì)細(xì)胞粘附因子(CAMs)也有一定的影響,該類成分可以激活相應(yīng)的細(xì)胞凋亡通路,也經(jīng)常作為抗心肌缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)出現(xiàn);將丹參-檀香合用之后,其作用靶點(diǎn)涉及到MAPK、PI3K/Akt和VEGF等經(jīng)典的細(xì)胞凋亡通路,還涉及到氧化磷酸化反應(yīng)和脂肪酸代謝等與線粒體相關(guān)的作用通路,推測二者合用之后,在抑制細(xì)胞凋亡、防止線粒體氧化損傷和增強(qiáng)能量代謝等方面產(chǎn)生了積極的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,丹參-檀香含藥血清高劑量組(5%)可以顯著上調(diào)(P0.01)細(xì)胞存活和抑制凋亡蛋白Vtn、PI3K和XIAP的表達(dá),顯著上調(diào)(P0.01)Akt1蛋白的磷酸化水平,并顯著下調(diào)(P0.01)促凋亡蛋白NF-κB、p38和MAPKAPK2的磷酸化水平,從而協(xié)同發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷的效果。結(jié)論:丹參-檀香藥對(duì)的最優(yōu)組合為丹參15g/天+檀香6g/天,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可以協(xié)同發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用,其作用機(jī)理可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)心臟組織氧化應(yīng)激環(huán)境有關(guān)。在OGD/R細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)中,丹參-檀香配伍使用具有極好心肌細(xì)胞保護(hù)作用,其作用效果要優(yōu)于丹參提取物單獨(dú)給藥和檀香提取物單獨(dú)給藥;丹參-檀香配伍和丹參單獨(dú)使用主要是通過抑制細(xì)胞凋亡來降低死亡細(xì)胞數(shù)的,而檀香單獨(dú)使用僅僅能夠減少晚期凋亡的細(xì)胞數(shù),對(duì)于早期凋亡的抑制效果并不明顯。同時(shí),丹參-檀香提取物可以有效調(diào)節(jié)線粒體膜電位的變化,說明其抗心肌細(xì)胞OGD/R損傷的機(jī)理也與防護(hù)線粒體損傷有關(guān)。通過蛋白組學(xué)研究,進(jìn)一步明確了丹參-檀香配伍使用可以抑制細(xì)胞凋亡、減輕線粒體損傷、降低ATP消耗、緩解鈣超載的狀態(tài),以達(dá)到抗心肌缺血再灌注損傷的效果,其作用機(jī)理的核心是通過Vtn/PI3K/Akt/NF-κB途徑增加細(xì)胞增殖和存活能力,同時(shí)通過p38/MAPK途徑抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

乙醇濃度60%，料液比1:20時(shí)，丹參提取物得率最高，約為27.87%。接下來，利用Design Expert軟件對(duì)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和優(yōu)化，闡明了三個(gè)因素之間的交互作用關(guān)系，如圖1-3所示：圖1 粉碎粒度和乙醇濃度對(duì)丹參提取物得率的交互影響圖1表明，在考察的參數(shù)范圍內(nèi)，丹參提取物得率與丹參藥材粉碎的粒度呈明顯的正相關(guān)，在固定乙醇溶液濃度的情況下，丹參提取物得率隨藥材粉碎粒度提高而升高；在固定藥材粉碎粒度的情況下，丹參提取物得率隨著乙醇濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的結(jié)果。

長春中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文33圖2 料液比和粉碎粒度對(duì)丹參提取物得率的交互影響圖2表明，在考察的參數(shù)范圍內(nèi)，丹參提取物得率與提取溶劑的加入倍數(shù)呈明顯的正相關(guān)，在固定藥材粉碎粒度的情況下，丹參提取物得率隨提取溶劑的加入倍數(shù)提高而升高；然而，在這兩個(gè)因素的交互作用中，粉碎粒度對(duì)丹參提取物得率的影響并不顯著。圖3 料液比和乙醇濃度對(duì)丹參提取物得率的交互影響圖3表明，在考察的參數(shù)范圍內(nèi)，丹參提取物得率與提取溶劑的加入倍數(shù)呈明顯的正相關(guān)，在固定乙醇濃度的情況下，丹參提取物得率隨提取溶劑的加入倍數(shù)提高而升高；同樣，在這兩個(gè)因素的交互作用中，乙醇濃度對(duì)丹參提取物得率的影響并不顯著。綜上所述，三個(gè)考察的因素中，料液比是影響最為顯著的一個(gè)因素，其次為藥材粉碎粒度和乙醇濃度

而升高；然而，在這兩個(gè)因素的交互作用中，粉碎粒度對(duì)丹參提取物得率的影響并不顯著。圖3 料液比和乙醇濃度對(duì)丹參提取物得率的交互影響圖3表明，在考察的參數(shù)范圍內(nèi)，丹參提取物得率與提取溶劑的加入倍數(shù)呈明顯的正相關(guān)，在固定乙醇濃度的情況下，丹參提取物得率隨提取溶劑的加入倍數(shù)提高而升高；同樣，在這兩個(gè)因素的交互作用中，乙醇濃度對(duì)丹參提取物得率的影響并不顯著。綜上所述，三個(gè)考察的因素中，料液比是影響最為顯著的一個(gè)因素，其次為藥材粉碎粒度和乙醇濃度，該觀察結(jié)果也得到了軟件理論計(jì)算的支持（見圖4）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2767065