【摘要】：目的血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)是嚴(yán)重影響老年人群健康的重大疑難疾病,也是目前唯一可以預(yù)防并具有一定可逆性的癡呆。由于目前的治療手段和治療藥物對改善患者認(rèn)知障礙的療效有限,因此,如何有效地控制該病的發(fā)展是當(dāng)前急需解決的一個醫(yī)學(xué)和社會問題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“治呆不治痰非其治也”,針對癡呆的治療,現(xiàn)代中醫(yī)在前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上也視“從痰論治”為治療方案之一。本課題組的前期研究顯示,滌痰湯能夠改善老年輕度認(rèn)知障礙大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力,但對血管性癡呆的治療作用尚未明確;另外,文獻(xiàn)調(diào)研表明,機(jī)體炎癥反應(yīng)和興奮性氨基酸的毒性作用是導(dǎo)致血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制,而該機(jī)制與中醫(yī)學(xué)的痰濁阻竅致病密切相關(guān)。因此,本文以血管性癡呆模型大鼠為研究對象,以滌痰湯為治療方法,針對滌痰湯對模型大鼠炎癥反應(yīng)及興奮性氨基酸毒性作用的干預(yù)機(jī)制,展開理論與實(shí)驗(yàn)研究,旨在探索VD發(fā)生發(fā)展過程中“痰濁阻竅”病機(jī)的分子生物學(xué)基礎(chǔ),明確滌痰湯對VD的治療作用及作用機(jī)制。方法本研究所采用的方法包括理論研究和實(shí)驗(yàn)研究。理論研究表明,血管性癡呆的發(fā)病原因之一是炎癥因子和興奮性氨基酸的表達(dá)增多;調(diào)控NMDA受體介導(dǎo)的興奮性氨基酸毒性作用和NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可作為血管性癡呆治療的一個方案和實(shí)驗(yàn)設(shè)計的一個出發(fā)點(diǎn)。因此,本文設(shè)計了以下以SPF級雄性SD大鼠為研究對象的實(shí)驗(yàn)研究方案:1、SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組,即空白組、模型組、滌痰湯高劑量組(以下簡稱“滌高組”)、滌痰湯中劑量組(以下簡稱“滌中組”)、滌痰湯低劑量組(以下簡稱“滌低組”)及西藥組,每組12只。2、空白組大鼠以普通飼料喂養(yǎng),其余5組大鼠均以高脂飲食喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后進(jìn)行造模,以改良2-血管阻斷法構(gòu)建血管性癡呆大鼠模型。3、大鼠造模成功后灌胃給藥,按照人與大鼠體表面積系數(shù)比確定給藥量。滌痰湯高、中、低劑量組給藥量分別為滌痰湯折合生藥量20 g·kg~(-1)、10 g·kg~(-1)、5 g·kg~(-1)體重,西藥組給藥量為鹽酸美金剛2 mg·kg~(-1)體重,空白組、模型組按照10 ml·kg~(-1)給予等容積生理鹽水灌胃。每日給藥1次,連續(xù)進(jìn)行4周。4、采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;光鏡下觀察大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化;ELISA法檢測大鼠血清中血脂(包括TC、TG、HDL、LDL)及Hcy濃度;Realtime PCR法檢測大鼠海馬CA1區(qū)炎癥相關(guān)指標(biāo)NF-κB、MMP-9、TNF-αmRNA表達(dá)量;ELISA法檢測大鼠血清炎癥相關(guān)指標(biāo)NF-κB、MMP-9、TNF-α含量變化;ELISA法檢測大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡因子P53、Bax、Bcl-2含量變化;以化學(xué)比色法檢測大鼠海馬CA1區(qū)Glu的濃度變化,Realtime PCR法、免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬CA1區(qū)NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)及分布情況。結(jié)果1、大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果:(1)定位航行實(shí)驗(yàn):在訓(xùn)練第5d,與空白組相比,模型組的逃避潛伏期明顯延長(P0.01);與模型組相比,滌痰湯各組及西藥組的逃避潛伏期均有所縮短(P0.05)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn):與空白組相比,模型組的穿越平臺次數(shù)明顯減少(P0.01),目標(biāo)象限時間明顯縮短(P0.01);與模型組相比,滌痰湯各組及西藥組的穿越平臺次數(shù)明顯增加(P0.01),目標(biāo)象限時間明顯延長(P0.01)。2、光鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整、排列紊亂,細(xì)胞胞體縮小、胞漿渾濁、核仁固縮,正常細(xì)胞數(shù)量明顯減少;滌痰湯各組及西藥組與模型組相比,椎體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊,正常細(xì)胞數(shù)量增多;細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,核及核仁清晰可見,細(xì)胞質(zhì)豐富,核固縮變性現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)。3、大鼠血脂情況檢測結(jié)果:與空白組比較,模型組大鼠的TG、TC和LDL明顯升高(P0.01),HDL明顯降低(P0.01)。與模型組比較,滌痰湯各組大鼠的TG、TC和LDL均降低(P0.05),HDL均升高(P0.05);西藥組的血脂情況無明顯改變(P0.05)。4、大鼠Hcy濃度檢測結(jié)果:模型組大鼠的血清Hcy濃度均明顯高于空白組(P0.01);滌痰湯各組大鼠的血清Hcy濃度均明顯低于模型組(P0.01)。5、大鼠炎癥因子及細(xì)胞凋亡因子檢測結(jié)果:(1)RT-PCR法結(jié)果顯示,大鼠海馬CA1區(qū),與空白組相比,模型組NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表達(dá)均明顯增多(P0.01);與模型組相比,滌痰湯各組及西藥組NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表達(dá)均明顯降低(P0.05);滌痰湯各組NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表達(dá)均低于西藥組(P0.05)。(2)ELISA法結(jié)果顯示,大鼠血清中,模型組NF-κB、MMP-9、TNF-α濃度均明顯高于空白組(P0.01);與模型組相比,滌痰湯各組NF-κB、MMP-9、TNF-α濃度均顯著降低(P0.01);與西藥組相比,滌高組、滌中組NF-κB濃度顯著降低(P0.01),滌高組、滌中組MMP-9、TNF-α濃度亦有所降低(P0.05)。大鼠海馬中,模型組大鼠P53、Bax的濃度高于空白組(P0.05),Bcl-2的表達(dá)低于空白組(P0.05);與模型組相比,滌痰湯各組及西藥組P53、Bax的濃度均顯著降低(P0.05),Bcl-2的含量均升高(P0.05);與西藥組相比,滌痰湯各組P53濃度、滌中組Bax濃度均有所降低(P0.05),滌痰湯各組Bcl-2的含量均升高(P0.05)。6、大鼠海馬CA1區(qū)Glu濃度、NMDA受體亞基表達(dá)及分布情況檢測結(jié)果:(1)RT-PCR法檢測NMDA受體mRNA的基因水平,結(jié)果顯示,模型組NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B mRNA表達(dá)均明顯高于空白組(P0.01);與模型組相比,滌痰湯各組及西藥組的NMDAR亞基NR1、NR2A、NR2B mRNA表達(dá)均降低(P0.05);其中滌高組的NR2B mRNA表達(dá)較西藥組更低(P0.05)。(2)免疫組化法檢測NMDA受體亞基NR1、NR2A、NR2B的陽性表達(dá)和分布情況,結(jié)果顯示,在各組大鼠的海馬CA1區(qū)中,NR1、NR2A、NR2B在模型組的陽性表達(dá)明顯多于空白組、滌痰湯各組及西藥組,且陽性細(xì)胞的染色更深,呈深棕色;滌痰湯各組及西藥組的NR1、NR2A、NR2B陽性細(xì)胞表達(dá)均少于模型組,染色呈較淺的棕黃色,其中滌高組的NR1表達(dá)方式與空白組相似。(3)Glu濃度的檢測結(jié)果顯示,模型組Glu濃度明顯高于空白組(P0.01);滌痰湯各組及西藥組Glu濃度均低于模型組(P0.05);與西藥組相比,滌痰湯各組Glu濃度亦顯著降(P0.01)。結(jié)論1、模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力明顯降低,海馬組織的病理改變典型,是成功的血管性癡呆動物模型。2、滌痰湯具有調(diào)節(jié)機(jī)體的血脂和血同型半胱氨酸水平的功能,從而起到保護(hù)VD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力的作用,是滌痰湯減輕血管性癡呆發(fā)病風(fēng)險的一個可能機(jī)制。3、滌痰湯能夠抑制NF-κB/MMP-9信號通路,促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和減少NF-κB、MMP-9、TNF-α、P53、Bax的表達(dá),以此保護(hù)血腦屏障的完整性,減輕炎癥反應(yīng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,減少細(xì)胞凋亡,使機(jī)體的認(rèn)知功能水平得到改善。4、滌痰湯可以通過降低VD大鼠模型海馬區(qū)NMDA受體及Glu的表達(dá)量,和減輕興奮性氨基酸的毒性作用,達(dá)到保護(hù)海馬神經(jīng)元和改善VD大鼠認(rèn)知功能障礙的目的。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文組 10.81±2.582)3)47.43±6.452)5)組 11.02±2.132)3)49.10±4.822)5)組 7.99±1.342)4)35.72±7.112)4)組 8.29±2.072)36.85±6.462)與空白組比較，1) P<0.01；與模型組比較，2) P<0.01；與西藥組比較，3) P<0.05，4) P><0.01

滌痰湯干預(yù)血管性癡呆大鼠炎癥反應(yīng)及興奮性氨基酸毒性作用的研究所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），以分析所得 P 值小于 0.05（P<0.05）表示比較的數(shù)據(jù)差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.3.3 結(jié)果(1) 各組大鼠海馬 CA1 區(qū) NF-κB、MMP-9、TNF-α mRNA 的 Realtime PCR結(jié)果

(1) 各組大鼠海馬 CA1 區(qū) NF-κB、MMP-9、TNF-α mRNA 的 Realtime PCR結(jié)果圖 4 NF-κB 擴(kuò)增曲線Fig. 4Amplification curve of NF-κB

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本文編號：2766670