【摘要】：前言肝癌在我國(guó)是致死率居第三位的惡性腫瘤,其中肝癌轉(zhuǎn)移又是導(dǎo)致肝癌患者高死亡率的主要原因之一,因此防治癌腫轉(zhuǎn)移成為肝癌相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)科學(xué)問題。近年有學(xué)者提出“內(nèi)風(fēng)”是引起腫瘤轉(zhuǎn)移的重要病機(jī),已有報(bào)道顯示常用息風(fēng)類中藥具有一定的抗腫瘤作用,并廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的輔助治療,但具體機(jī)制尚未明確。本研究分別從在體和離體實(shí)驗(yàn)兩方面,觀察息風(fēng)藥全蝎對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響和對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的作用,探討其可能作用機(jī)制。為全蝎在臨床防治肝癌轉(zhuǎn)移的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)一全蝎對(duì)體內(nèi)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響【目的】觀察單味息風(fēng)藥全蝎水煎劑對(duì)荷瘤鼠體內(nèi)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響,以及對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的作用�！痉椒ā繉�(shí)驗(yàn)用裸鼠分為模型組、全蝎組和空白對(duì)照組,其中模型組和全蝎組裸鼠通過尾靜脈注射法,在體內(nèi)接種穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶Luciferase的肝癌細(xì)胞Hepa1-6,建立肝癌轉(zhuǎn)移模型,空白對(duì)照組不進(jìn)行細(xì)胞接種。一周后全蝎組裸鼠以全蝎水煎劑(全蝎含藥量0.091g/20g)進(jìn)行灌胃,模型組和空白對(duì)照組則分別以等體積磷酸緩沖鹽溶液(PBS)灌胃。觀察各組動(dòng)物一般情況,并通過活體成像系統(tǒng)記錄各組動(dòng)物體內(nèi)肝癌轉(zhuǎn)移灶數(shù)量及大小;通過蘇木素伊紅(HE)染色對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組裸鼠肺臟及肝臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;通過免疫組化染色和蛋白印跡分析的方式,觀察比較各實(shí)驗(yàn)組肺組織腫瘤病變區(qū)域EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的改變�！窘Y(jié)果】實(shí)驗(yàn)過程中各組裸鼠體重變化無(wú)明顯差異,4周內(nèi)均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。全蝎組裸鼠體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶熒光信號(hào)在數(shù)量、面積和強(qiáng)度等各方面均明顯低于模型組(P0.05);HE染色可見全蝎組裸鼠肺臟、肝臟病變區(qū)域組織形態(tài)與模型組相同,但癌巢數(shù)量和面積均明顯小于模型組(P0.05);免疫組化染色結(jié)果提示與全蝎組比較,模型組肺組織E-cadherin染色明顯減少,N-cadherin染色顯著增加;蛋白印跡分析進(jìn)一步明確與空白對(duì)照組比較,模型組肺組織E-cadherin表達(dá)水平顯著降低(P0.001),N-cadherin表達(dá)水平顯著升高(P0.001),說(shuō)明模型組肺組織發(fā)生EMT改變;而與同期模型組比較,全蝎組肺組織E-cadherin表達(dá)量顯著增加(P0.001),而N-cadherin表達(dá)量則明顯降低(P0.01),說(shuō)明全蝎干預(yù)后肺組織腫瘤灶內(nèi)EMT狀態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)變�！窘Y(jié)論】息風(fēng)藥全蝎對(duì)荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均表現(xiàn)出有效的抑制作用,并明顯抑制了相關(guān)組織EMT的狀態(tài);同時(shí)全蝎對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠作用過程中未表現(xiàn)出明顯的毒副反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)二全蝎對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響【目的】觀察單味息風(fēng)藥全蝎含藥血清對(duì)鼠源性肝癌細(xì)胞Hepa1-6體外增殖、凋亡活性和侵襲、遷移能力的影響�！痉椒ā繉�40只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和全蝎組,每組各20只。其中全蝎組大鼠每100g體重每天予全蝎水煎劑灌胃量為315ml(含全蝎0.315g),對(duì)照組給予等體積PBS灌胃,連續(xù)灌胃3天后采血,制備全蝎含藥血清和對(duì)照血清。將肝癌細(xì)胞Hepa1-6分為對(duì)照組和全蝎組,分別給予對(duì)照血清和全蝎含藥血清培養(yǎng)。通過EdU染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖、TUNEL熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞體外遷移能力、Transwell小室法檢測(cè)不同含藥血清干預(yù)下細(xì)胞的侵襲能力�！窘Y(jié)果】與對(duì)照組細(xì)胞相比較,全蝎組EdU標(biāo)記的陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.01),而TUNEL標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)則顯著增多(P0.001);同時(shí)全蝎組肝癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力與對(duì)照組相比也均明顯降低(P0.001、P0.05)�！窘Y(jié)論】息風(fēng)藥全蝎可有效降低肝癌細(xì)胞Hepa1-6體外的增殖活性,誘導(dǎo)促進(jìn)其凋亡,并對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移能力有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)三全蝎對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的影響【目的】通過構(gòu)建肝癌細(xì)胞EMT模型,進(jìn)一步研究息風(fēng)藥全蝎對(duì)肝癌細(xì)胞及組織EMT過程產(chǎn)生的具體作用影響和潛在作用機(jī)制�！痉椒ā繉⒏伟┘�(xì)胞Hepa1-6分為模型組、全蝎組和對(duì)照組,其中模型組和全蝎組細(xì)胞分別加入鼠源性TGF-β1(10ng/mL)誘導(dǎo)72h,誘導(dǎo)的同時(shí)模型組給予對(duì)照血清干預(yù),全蝎組給予全蝎含藥血清干預(yù);而對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo),僅給予對(duì)照血清干預(yù)。采用qRT-PCR和Western Blot對(duì)比各組細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的變化,并進(jìn)一步通過免疫組化染色和蛋白印跡分析的方式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一中裸鼠組織樣本相關(guān)EMT轉(zhuǎn)錄因子的變化。【結(jié)果】qRT-PCR和Western Blot均顯示:與空白組比較,模型組細(xì)胞E-cadherin下調(diào)(P0.01),N-cadherin上調(diào)(P0.001);與模型組比較,全蝎組E-cadherin顯著提高,而N-cadherin則大幅下降(P0.05)。同時(shí)藥物全蝎干預(yù)前后各組細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的變化趨勢(shì)最為顯著,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;免疫組化染色提示與模型組比較,全蝎組肺組織Snail因子染色區(qū)域顯著減少;蛋白印跡法進(jìn)一步檢測(cè)并比較荷瘤鼠肺組織轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):模型組肺組織snail因子的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P0.01),而全蝎組肺組織內(nèi)Snail的表達(dá)水平則顯著下調(diào)(P0.01),說(shuō)明全蝎對(duì)模型鼠體內(nèi)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用�！窘Y(jié)論】息風(fēng)藥全蝎可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá),對(duì)EMT過程發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用,有效減弱肝癌細(xì)胞侵襲能力并抑制肝癌的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移,為息風(fēng)藥全蝎在臨床防治肝癌轉(zhuǎn)移的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

1-1 不同實(shí)驗(yàn)組肝癌轉(zhuǎn)移模型鼠體重變化情況c+細(xì)胞后不同實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重變化經(jīng)比較無(wú)明顯癌荷瘤小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移體成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞接種 2 周后方可檢測(cè)到 4 周作為時(shí)間點(diǎn)對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤信號(hào)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況和轉(zhuǎn)移灶形成1-2A 所示：藥物干預(yù) 2 周后可見，模型組 8 只積、強(qiáng)熒光信號(hào)的腫瘤灶改變，而全蝎組 8 只病變區(qū)域在數(shù)量、面積和所表達(dá)熒光信號(hào)的強(qiáng)干預(yù) 4 周后觀察發(fā)現(xiàn)，模型組 8 只裸鼠體內(nèi)全多、面積大、熒光信號(hào)強(qiáng)烈，而全蝎組僅 6 只Days after intravenous inoculation

圖 1-3 蘇木素伊紅（H&E）染色檢測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移模型鼠組織形態(tài)學(xué)改變鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型建立后分別采用全蝎水煎劑和 PBS 進(jìn)行灌胃治療，各組裸肝臟組織 H&E 染色結(jié)果，下行圖片為上行圖片中紅框內(nèi)容的放大部分。比例μm；B) 各組荷瘤鼠肺臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量統(tǒng)計(jì)和比較，*P<0.05；C) 各組荷瘤鼠瘤面積統(tǒng)計(jì)和比較，*P<0.05。息風(fēng)藥全蝎抑制肝癌 EMT我們通過免疫組化染色的方式，觀察比較各實(shí)驗(yàn)組肺組織腫瘤病變區(qū)域上充質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度和狀態(tài)。如圖 1-4A 所示，棕色區(qū)域即為所檢測(cè)的目的蛋白區(qū)域。鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)：在模型組裸鼠肺組織中代表上皮細(xì)胞標(biāo)志dherin 幾乎沒有顯色，而在全蝎組裸鼠肺組織中，其陽(yáng)性顯色區(qū)域明顯增加模型組裸鼠肺組織中，代表間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的 N-cadherin 顯色非常明顯組的 N-cadherin 陽(yáng)性染色面積則大幅減少。說(shuō)明藥物全蝎干預(yù) 4 周后，肺ControlScorpionControlScorpionR

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文深，而 N-cadherin 的條帶則明顯變淺。如圖 1-4C 所示，對(duì)各組條帶進(jìn)行灰統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組比較，模型組 E-cadherin 表達(dá)水平顯著<0.001），N-cadherin 表達(dá)水平顯著增高（P<0.001），說(shuō)明模型組發(fā)生 EMT 轉(zhuǎn)期模型組相比較，全蝎組裸鼠肺組織 E-cadherin 表達(dá)量顯著增加（P<0.001）adherin 表達(dá)量則明顯減少（P<0.01）。說(shuō)明息風(fēng)藥全蝎干預(yù) 4 周后肺組織腫MT 狀態(tài)發(fā)生了變化。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2763970