【摘要】：本論文基于“血脈雙治”理論,采用現(xiàn)代分子藥理學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方XXT片(Xueshuan Xinmaining Tablet,XXT)開展了“治血”和“治脈”的活性研究,并從基因和蛋白調(diào)控以及代謝途徑等方面進(jìn)行了機(jī)制探討。闡明了XXT可通過(guò)調(diào)控F13a1,Car1和Tbxa2r等基因來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體血流狀態(tài),而起到抗血液循環(huán)內(nèi)阻的作用;另通過(guò)上調(diào)Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信號(hào)通路的蛋白表達(dá),發(fā)揮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用;進(jìn)一步通過(guò)代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),XXT通過(guò)作用于類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝和脂類代謝等3條信號(hào)通路而發(fā)揮“血脈雙治”的作用;篩選出6個(gè)對(duì)抗凝血因子Xa(FXa)選擇性較高的化合物。本論文取得的創(chuàng)新性成果如下:1.首次采用藥效學(xué)開展了XXT改善血流狀態(tài)的“治血”研究,結(jié)果顯示XXT可顯著降低全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞比容、EAI、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)等血流變和凝血指標(biāo),證明了XXT具有良好的抗血液循環(huán)內(nèi)阻的作用。2.采用PCR Array技術(shù),利用Matlab軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,首次對(duì)XXT改善血流狀態(tài)的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果表明:與正常組比較,模型組有373條基因表達(dá)顯著上調(diào),62條基因表達(dá)顯著下調(diào);與模型組比較,XXT組有307條基因表達(dá)顯著上調(diào),194條基因表達(dá)顯著下調(diào),差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、有絲分裂、細(xì)胞遷移及增值、免疫調(diào)節(jié)等細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑;F13a1,Car1和Tbxa2r等基因在模型組顯著上調(diào),而在XXT預(yù)處理后顯著下調(diào),說(shuō)明XXT可通過(guò)調(diào)控這些基因而起到改善血流狀態(tài)的作用。3.采用MTT比色法測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)存活率;采用FACS Calibur流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧(ROS)的水平,首次證明了XXT抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的活性。4.采用PCR Array、Real-Time PCR和Western Blotting技術(shù),首次探討了XXT抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)XXT可顯著調(diào)控Nrf2及其下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,且呈劑量依賴性;XXT通過(guò)上調(diào)Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信號(hào)通路的蛋白表達(dá)而起到抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用。5.采用UPLC-Q/TOP-MS技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析,首次完成了XXT的代謝組學(xué)研究,揭示了XXT通過(guò)調(diào)控類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝和脂類代謝等內(nèi)源性代謝物通路而起到治療作用。首次發(fā)現(xiàn)了血瘀證可引起機(jī)體體內(nèi)類固醇生物合成的紊亂,而復(fù)方中藥可通過(guò)調(diào)控這條物質(zhì)合成途徑,改善血瘀證,為血瘀證的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)和新的思路。6.采用顯色底物法,首次從XXT復(fù)方的14個(gè)Q-Markers物質(zhì)及有效成分中篩選出了蘆丁、丹酚酸B、綠原酸、人參皂苷Rg3、-Rg2和原人參三醇等6個(gè)選擇性較高的FXa的活性成分,應(yīng)用Schr?dinger軟件中的Glide XP模塊對(duì)各抑制劑與FXa進(jìn)行分子對(duì)接,進(jìn)一步模擬各活性成分與FXa之間的相互作用。上述創(chuàng)新性成果,充分說(shuō)明了XXT的“血脈雙治”分子藥理活性及其作用機(jī)制,為復(fù)方中藥XXT的二次開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 3.1 總 RNA 提取后甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖ig. 3.1 The formaldehyde-induced agarose gel electrophoresis (SDS-PAGafter total RNA extraction異基因篩選及聚類分析實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較芯片 cy5 和 cy3 的 Ratio 值并結(jié)合各生物學(xué)重復(fù) Ratio 的出表達(dá)基因，篩選差異表達(dá) 2 倍以上的基因?yàn)椴町惢�。模型組與正 N）相比，有 435 個(gè)基因差異表達(dá)，其中 373 條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上因出現(xiàn)顯著表達(dá)下調(diào)；而給藥組與模型組相比（Y vs M），有 501 個(gè)表達(dá)，其中 307 條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào)，194 條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)下表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類，如圖 3.2 所示。圖中的四張芯片分別是 M1 vs2、Y1 vs M1、Y2 vs M2。圖中的差異基因主要可以分成四個(gè)區(qū)域，

圖 3.2 差異表達(dá)基因與樣本芯片的二維聚類Fig. 3.2 Hierarchical clustering of the differentially expressed genes.注：圖中的橫向 4 列為芯片樣本進(jìn)行聚類，編號(hào)為樣本名稱，縱向?yàn)椴钜蜻M(jìn)行聚類。標(biāo)注為不同顏色表示的上調(diào)及下調(diào)基因及其差異倍率.3 差異基因功能分析及 pathway 分類對(duì)差異基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，血瘀模型中 8 個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因在 XX出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。3 個(gè)血瘀模型中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的基因在 XXT 治療后出調(diào)，見表 3.6。我們分析了這些基因的功能，發(fā)現(xiàn)許多基因與凝血相關(guān)a1, Car1 和 Tbxa2r。使用 David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)表達(dá)顯著差異的基因（Fold ch進(jìn)行 KEGG 及 GO pathway 富集分析。其中差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞周

圖 3.3 F13a1, Car1 及 Tbxa2r 的 mRNA 表達(dá)水平Fig. 3.3 The mRNA expression of F13a1, Car1 and Tbxa2r芯片，又稱 DNA 芯片(DNA Chips)、DNA 微陣列（DNA Microa因探針或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或，形成致密有序的 DNA 分子點(diǎn)陣，按堿基配對(duì)的特性與樣品 D過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行解讀和分析獲取大量信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品高效醫(yī)學(xué)診斷，是綜合微電子學(xué)、物理學(xué)、生化技術(shù)及生命科學(xué)等眾綜合的高新科技�；蛐酒蚱渚哂锌焖�、高效、大規(guī)模、高容等特點(diǎn)，被廣泛的推廣使用�；蛐酒夹g(shù)的原理是先將已知核

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本文編號(hào)：2763923