【摘要】：目的:將來自于云南傳統(tǒng)藥物臭靈丹具有抗流感病毒的活性成分C8(倍半萜類混合物)作進(jìn)一步的組分分析,并分離出具有抗病毒成分的化學(xué)單體。研究化學(xué)單體對(duì)于不同亞型流感病毒的抑制作用,并進(jìn)一步研究其對(duì)于流感病毒復(fù)制周期不同環(huán)節(jié)的阻斷作用強(qiáng)度,同時(shí)明確單體對(duì)于流感病毒感染引起的相關(guān)宿主信號(hào)通路和細(xì)胞因子、趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的變化,從而闡明化學(xué)單體抗流感病毒及病毒引起相關(guān)炎癥的作用機(jī)制,為臭靈丹的臨床用藥提供基礎(chǔ)研究參考。方法:利用超高效液相色譜對(duì)臭靈丹的C8(倍半萜類混合物)成分進(jìn)行組分分析和定量,并通過硅膠柱層析進(jìn)一步分離化學(xué)單體。對(duì)于分離化學(xué)單體,以細(xì)胞病變法進(jìn)行不同呼吸道病毒和不同亞型流感病毒的體外藥效篩選,并針對(duì)篩選有效的單體開展預(yù)防、治療和直接作用的三個(gè)藥效作用模式篩選,并利用血凝抑制試驗(yàn)、病毒聚合酶活性抑制試驗(yàn)、NF-КB激活試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)等5個(gè)試驗(yàn)鑒別單體抗病毒藥效作用于流感病毒的生活復(fù)制周期的具體環(huán)節(jié),最后利用熒光定量PCR技術(shù)尋找單體對(duì)于流感感染引起的主要細(xì)胞因子和趨化因子mRNA表達(dá)的抑制作用,并通過Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)在蛋白水平驗(yàn)證相關(guān)因子表達(dá)水平的變化規(guī)律。成果:(一)臭靈丹桉烷型倍半萜類化合物的分離、鑒定及抗病毒譜研究結(jié)果通過對(duì)C8進(jìn)行硅膠柱層析反復(fù)分離,TLC指導(dǎo)合并(碘熏顯色)得到化合物1,醋酸乙酯重結(jié)晶純化得到化合物2,經(jīng)過超高效液相色譜和四重桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定化合物的含量分別為107.98mg/g和111.3mg/g。通過上述兩個(gè)化合物進(jìn)行核磁共振技術(shù)的鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)化合物1、2分別為臭靈丹酸和臭靈丹二醇。對(duì)臭靈丹酸和臭靈丹二醇的進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)和抗呼吸道病毒藥效篩選試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)化合物的最大無毒濃度分別為278.9μg/mL和100μg/mL,臭靈丹酸對(duì)不同亞型的甲型H1N1流感病毒均具有抑制作用,其對(duì)于甲型H1N1流感病毒PR8株、新甲型H1N1流感病毒California04株、新甲型H1N1流感病毒GIRD07株(臨床分離株)的半數(shù)抑制濃度分別為37.14μg/mL、21.75μg/mL和9.47μg/mL,而對(duì)于其他H3N2、H7N3、H6N3和H9N2的人或禽流感均在最大無毒濃度下不顯示抑制效應(yīng),而且對(duì)于呼吸道合胞病毒、I型單純皰疹病毒、腸道病毒71型和柯薩奇病毒16型均無抑制病毒復(fù)制的作用。為了更進(jìn)一步確認(rèn)臭靈丹酸對(duì)于流感病毒的抑制作用,本研究采用子代病毒減少試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度臭靈丹酸處理的流感病毒感染細(xì)胞后,細(xì)胞上清的子代病毒數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在25-100μg/mL的范圍內(nèi)對(duì)甲型H1N1流感病毒PR8株具有明顯的抑制作用,而且與病毒對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。臭靈丹二醇對(duì)不同亞型的流感病毒以及其他呼吸道和腸道病毒在體外均不顯示抗病毒作用。(二)臭靈丹酸抗甲型流感病毒的作用機(jī)制研究通過對(duì)臭靈丹酸抗甲型H1N1流感病毒的藥物作用模式檢測(cè),結(jié)果顯示其對(duì)于病毒顆粒沒有抑制作用,對(duì)于細(xì)胞沒有保護(hù)預(yù)防作用,只有在治療模式下可以發(fā)揮抑制病毒作用,其半數(shù)有效濃度為35.93μg/mL。此外,針對(duì)病毒復(fù)制周期不同的靶點(diǎn),開展了臭靈丹酸作用靶點(diǎn)研究,在血凝抑制試驗(yàn)證實(shí)該化合物對(duì)于流感病毒血凝素沒有抑制作用。在神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臭靈丹酸在668.1μg/mL濃度下對(duì)于新甲型H1N1流感病毒California04株的神經(jīng)氨酸酶具有輕度的抑制作用,表明其可以通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性來阻止子代病毒的釋放。對(duì)流感病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)-病毒聚合酶活性進(jìn)行抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示,臭靈丹酸在10-80μg/mL范圍內(nèi)對(duì)甲型H1N1流感病毒的聚合酶活性具有輕度抑制作用。由于NF-КB信號(hào)通路活化對(duì)于流感病毒復(fù)制非常關(guān)鍵,因此本研究開展了對(duì)該通路活化的抑制試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)臭靈丹酸濃度達(dá)到20-80μg/mL的時(shí)候,無論是由流感病毒或者是TNF-α刺激的NF-КB通路活化的作用均可被抑制。由于NF-КB通路被抑制以后,會(huì)導(dǎo)致病毒不能發(fā)生核輸出,而被滯留在細(xì)胞核內(nèi),因此本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證臭靈丹酸對(duì)NF-КB通路活化的抑制作用,開展了流感病毒蛋白核輸出實(shí)驗(yàn),在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)臭靈丹酸處理后的病毒感染細(xì)胞,其病毒核蛋白無法通過細(xì)胞核輸出,導(dǎo)致其滯留于細(xì)胞核內(nèi),沒有辦法產(chǎn)生子代病毒。(三)臭靈丹酸對(duì)宿主流感感染相關(guān)細(xì)胞因子變化的作用研究由于臭靈丹酸的僅能抑制甲型H1N1流感病毒,對(duì)病毒的神經(jīng)氨酸酶和聚合酶具有輕度抑制作用,但是能明顯抑制病毒感染引起的NF-КB通路的活化,因此本研究進(jìn)行了相關(guān)炎癥因子的表達(dá)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上,該化合物在25-100μg/mL濃度下能明顯抑制甲型H1N1病毒PR8株感染所致的IP-10、MIP-1β和IL-6的mRNA表達(dá)升高,在100μg/mL下能抑制MCP-1的表達(dá)升高;在25-100μg/mL濃度下能明顯抑制甲型H9N2禽流感病毒感染所致的IP-10和MIP-1β的表達(dá)升高,在100μL/mL濃度下能明顯抑制CCL-5和TNF-α的表達(dá)升高。為了進(jìn)一步確認(rèn)其對(duì)于炎癥因子的抑制效應(yīng),本研究在蛋白水平上利用bio-plex平臺(tái)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示臭靈丹酸在25-100μg/mL濃度下能明顯抑制甲型H1N1病毒PR8株感染所致IP-10和IL-6的蛋白水平升高,在100μg/mL濃度下抑制TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高;在25-100μg/mL濃度下能明顯抑制甲型H9N2禽流感病毒感染所致的IP-10和IL-6的蛋白表達(dá)水平升高,在100ug/mL濃度下能明顯抑制CCL-5和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:從臭靈丹的倍半萜類混合物中分離兩個(gè)主要成分臭靈丹酸和臭靈丹二醇,證實(shí)臭靈丹酸在體外具有抗甲型H1N1流感病毒的作用,并且該作用是通過抑制神經(jīng)氨酸酶和病毒聚合酶活性,以及病毒核蛋白輸出而實(shí)現(xiàn)的,此外該化合物還能有效抑制人或禽流感感染引起的炎癥因子的升高。臭靈丹二醇對(duì)于流感病毒、呼吸道合胞病毒及腸道病毒均無抑制作用。藥效結(jié)果表明臭靈丹酸的直接抗病毒作用不強(qiáng),而且只對(duì)甲型H1N1流感有效,但是其對(duì)于病毒感染引起的相關(guān)宿主的細(xì)胞因子、趨化因子的信號(hào)通路具有很好的抑制作用,而且不受甲型流感病毒亞型的限制,可以考慮作為流感感染相關(guān)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑做進(jìn)一步的研究和開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2763905