【摘要】：目的1.觀察氪激光建立實驗性脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型的可行性和成功率,為CNV的相關實驗研究奠定基礎。2.觀察 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與 TLR-4/NF-κB/IL-6 信號通路在CNV形成中的作用。3.觀察中藥加減駐景方和Conbercept對實驗性CNV的干預作用,以及對AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路和TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路活性的影響,比較不同治療對CNV的干預效果,推測可能存在的干預機制,為CNV的治療提供理論及實驗性依據(jù)。方法1.通過659 nm氪激光誘導棕色挪威(brown Norway,BN)大鼠建立實驗性CNV動物模型。分別于光凝后7 d、14 d、21 d,通過眼底熒光血管造影(fundus fluorescein angiograph,FFA)與引哚青綠血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)檢查觀察CNV變化。FFA與ICGA檢查后處死大鼠,制作眼組織病理學標本,通過HE染色和CD105免疫組織化學染色法觀察CNV變化。2.通過659 nm氪激光誘導BN大鼠建立CNV動物模型。分別于光凝后7 d、14 d、21 d處死取材制作病理學標本,采用免疫組織化學法觀察CNV組織中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路相關蛋白的表達量。于光凝后21 d,處死取材,采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術檢測 眼組織中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路相關因子mRNA的表達情況。3.通過659 nm氪激光誘導BN大鼠建立CNV動物模型。造模后的大鼠被隨機分為模型組、中藥組、西藥組和聯(lián)合治療組。模型組大鼠用生理鹽水灌胃,中藥組用加減駐景方灌胃治療,西藥組用玻璃體腔注射Conbercept治療,聯(lián)合治療組用玻璃體腔注射Conbercept和加減駐景方灌胃治療。分別于光凝后7 d、14d、21d,進行FFA與ICGA檢查。FFA與ICGA檢查后每組處死6只大鼠制作病理學標本,通過HE染色觀察CNV變化,通過免疫組織化學法觀察各組大鼠 CNV 組織中 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路與 TLR-4/NF-κB/IL-6 信號通路相關蛋白的表達量。于光凝后21 d,每組處死12只大鼠獲取眼組織標本,使用RT-qPCR和蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測觀察各組大鼠AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路與 TLR-4/NF-κB/IL-6 信號通路 mRNA 和蛋白的相對表達量。結果1.模型組BN大鼠光凝后7 d的FFA圖像出現(xiàn)明顯熒光素滲漏,14 d時滲漏強度逐漸增強(P0.05),21 d時無明顯變化(P0.05),有熒光素滲漏的光斑在ICGA均呈充盈狀態(tài)。光凝后7 d、14 d、21 d CNV發(fā)生率分別為77.08%、85.42%、89.58%,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。組織病理學結果顯示隨光凝時間推移,CNV中央厚度逐漸增加(P0.05)。光凝后7 d,CNV中可見CD105因子標記的新生血管,陽性反應物呈棕黃色;14 d陽性反應物逐漸增多(P0.05);21d無明顯變化(P0.05)。正常BN大鼠視網(wǎng)膜組織結構中CD105表達呈陰性,未見棕黃色反應物。2.AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 和 IL-6 蛋白在模型組BN大鼠視網(wǎng)膜組織中均呈強陽性表達,CNV組織中可見大量黃棕色陽性反應物。HIF-1α、TLR-4和IL-6蛋白在光凝后7 d時有明顯表達,在14 d時達到高峰,21 d時逐漸減少(P0.05)。AKT、mTOR蛋白表達量在7d時最多,21 d時緩慢減少(P0.05)。VEGF在光凝后7d時表達量達到最大值,隨后逐漸減少(P0.05)。NF-κB在光凝后7 d時有明顯表達,在14 d時達到高峰,21 d時變化不明顯(P0.05)。RT-qPCR結果顯示,模型組AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB與IL-6 mRNA相對表達量較對照組均有顯著增強(P0.05)。3.光凝后7 d、14 d、21 d,模型組與各治療組CNV形成率達70%以上,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。各治療組FFA熒光素滲漏在光凝后7 d時最強,隨后變化不明顯,有熒光滲漏的光凝斑在ICGA呈充盈狀態(tài)。光凝后7 d,中藥組與模型組熒光素滲漏強度較高,西藥組次之,聯(lián)合組滲漏程度最輕(P0.05)。14 d與21 d時,各治療組熒光素滲漏強度均弱于模型組,聯(lián)合組治療效果最優(yōu),西藥組治療效果優(yōu)于中藥組(P0.05)。光凝后7 d,西藥組和聯(lián)合組CNV中央厚度都顯著低于模型組和中藥組(P0.05)。光凝后14 d與21 d時,各治療組CNV中央厚度均低于模型組,聯(lián)合組降低CNV中央厚度的效果最優(yōu),西藥組次之,西藥組優(yōu)于中藥組(P0.05)。免疫組織化學結果顯示,各治療組視網(wǎng)膜光凝區(qū) CNV組織中AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 與 IL-6 蛋白的表達都呈陽性,CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應物。隨著治療時間延長,各治療組目的蛋白表達量均低于模型組(P0.05)。光凝后7 d到21 d,AKT、mTOR、HIF-1α和VEGF的表達量在中藥組、西藥組和聯(lián)合組中呈現(xiàn)依次遞減趨勢(P0.05),TLR-4和NF-κB表達量在西藥組最高,聯(lián)合組最低(P0.05)。在光凝后7 d與14d時,聯(lián)合組IL-6表達量低于西藥組(P0.05)。光凝后21 d,中藥組和聯(lián)合組均低于西藥組(P0.05)。RT-qPCR結果顯示,模型組與各治療組目的基因mRNA相對表達量較對照組均有明顯增多(P0.05)。除mTOR以外,各治療組目的基因mRNA相對表達量均低于模型組(P0.05),中藥組mTOR mRNA相對表達量與模型組無明顯差異(P0.05)。各治療組AKT、mTOR、VEGF和NF-κB mRNA相對表達量由高到低依次為中藥組、西藥組和聯(lián)合組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。中藥組HIF-1αmRNA相對表達量高于西藥組和聯(lián)合組(P0.05),西藥組和聯(lián)合組之間無明顯差異(P0.05)。TLR-4 mRNA相對表達量聯(lián)合組最低(P0.05),西藥組與中藥組無明顯差異(P0.05)。IL-6 mRNA相對表達量中藥組最低(P0.05),西藥組與聯(lián)合組無明顯差異(P0.05)。Western blotting結果顯示,實驗組各目的蛋白相對表達量較對照組均有明顯增多(P0.05),除AKT蛋白以外,各治療組目的蛋白相對表達量均低于模型組(P0.05)。AKT和HIF-1α蛋白相對表達量在中藥組中高于西藥組和聯(lián)合組(P0.05)。mTOR與VEGF蛋白相對表達量由高到低依次為中藥組、西藥組和聯(lián)合組(P0.05)。TLR-4蛋白相對表達量在西藥組中高于中藥組和聯(lián)合組(P0.05)。NF-κB蛋白相對表達量在中藥組中高于西藥組和聯(lián)合組(P0.05)。IL-6蛋白相對表達量在中藥組中低于西藥組與聯(lián)合組(P0.05)。結論1.659 nm氪激光誘導BN大鼠建立CNV模型成功率高,且具有與人類CNV相似的病理過程和細胞組成。2.FFA聯(lián)合ICGA檢查可以動態(tài)觀察CNV變化,熒光滲漏強度AOD值可用于半定量評估CNV形成情況。3.AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路與 TLR-4/NF-κB/IL-6 信號通路在 CNV動物模型中被激活。AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路的活化促進了實驗性CNV的形成。4.聯(lián)合組干預CNV的效果明顯優(yōu)于中藥組和西藥組,中西藥聯(lián)合治療對AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路的活性具有明顯的抑制作用。5.加減駐景方具有抑制實驗性CNV的作用。加減駐景方可以降低AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路與TLR-4/NF-κB/IL-6信號通路的活性,加減駐景方可能是通過上述信號通路發(fā)揮多靶點抑制CNV的作用。
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

３．１．１眼底表現(xiàn)逡逑正常ＢＮ大鼠眼底彩照可見視網(wǎng)膜顏色淡紅，圓形視盤居中，視網(wǎng)膜血管逡逑圍繞視盤呈放射狀分布。見圖１。逡逑模型組ＢＮ大鼠視網(wǎng)膜彩照可見在血管間隙分布的光凝斑，大部分光凝斑逡逑有氣泡形成，光凝中心呈濃集的白點，周圍呈環(huán)形灰白色水腫，光凝斑邊界不逡逑清，少數(shù)光斑下可透見少量出血。隨著光凝后時間推移，視網(wǎng)膜水腫逐漸減輕，逡逑視網(wǎng)膜下出血逐漸吸收，光凝斑邊界逐漸清晰，部分相鄰的光凝斑可出現(xiàn)融合。逡逑見圖２。逡逑３．１．２邋ＦＦＡ、ＩＣＧＡ表現(xiàn)及熒光素n蚵粒希鬧到峁義險＃攏未笫螅疲疲鐐枷窨杉優(yōu)嘆又�，视网膜血管睋]饉爻溆�，血固d咤義閑巫勻紓鼙詮饣暾抻饉厴�，１Ｃ苛示脉驴Pぱ艸釋礎＜義賢跡常浚礎ｅ義夏Ｐ妥椋攏未笫螅疲疲鐐枷窨杉籩戮確植莢諮薌湎兜撓饉厴�，垣k義掀謨饉厴┏實闋

本文編號：2763116