【摘要】：炎癥是機(jī)體對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),病原體的感染和組織損傷都能引起炎癥反應(yīng),可發(fā)生于任何組織和器官。對(duì)于人類健康,炎癥是把雙刃劍,一方面能夠清除病原體和恢復(fù)組織損傷,有利于維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài);另一方面,過度的、異常的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織的病變和二次損傷,也是許多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。目前臨床抗炎藥物開始出現(xiàn)不良反應(yīng),因此,尋找新的低毒高效的炎癥抑制劑是我們的重要任務(wù)。天然萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生而來的化合物,其結(jié)構(gòu)類型繁多,活性豐富,并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)萜類化合物具有較好的抗炎活性,這為我們發(fā)現(xiàn)新抗炎藥物提供了新思路。本論文運(yùn)用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞體外炎癥模型,對(duì)大戟屬植物金剛纂(Euphorbia neriifolia L.)、火殃|(Euphorbia antiquorum)、霸王鞭(Euphorbia royleana)等植物乙酸乙酯萃取相不同餾分進(jìn)行NO抑制活性篩選發(fā)現(xiàn)三種植物的70%和90%甲醇/水餾分具有較好的抑制活性,尤其是90%甲醇/水餾分IC_(50)分別為0.4μg/mL,15.0μg/m L,6.85μg/m L,進(jìn)一步對(duì)這三種植物活性部位分離純化獲得的單體化合物,以及從纈草屬植物蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones),雷公藤屬植物昆明山海棠(T.hypoglaucum),獐牙菜屬植物獐牙菜(Swertia bimaculata),槐屬植物苦參(Sophoraflavescens)等其他植物中得到的共134個(gè)單體化合物進(jìn)行抑制NO生成活性篩選。這些化合物包括:91個(gè)萜類化合物(環(huán)烯醚萜,倍半萜,巨大戟烷型二萜,千金子烷型二萜,貝殼烷型二萜,松香/海松烷型二萜,阿替生烷型二萜和三萜);其他結(jié)構(gòu)類型的化合物有43個(gè)。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17個(gè)化合物顯著的抑制NO生成,分別為13個(gè)萜類化合物和3個(gè)異戊烯基黃酮以及1個(gè)木脂素類化合物。經(jīng)構(gòu)-效分析發(fā)現(xiàn),萜類化合物母核上引入�；梢蕴岣呋钚�,并隨著酰基數(shù)量越多、�；兼溤介L活性越好;多元環(huán)萜類C環(huán)上的取代基類型是發(fā)揮抗炎活性的主要原因,并且松香/海松烷型二萜和巨大戟烷型二萜具有較好的抑制活性,因此,我們將對(duì)抑制活性較好這幾種類型的化合物進(jìn)行抗炎活性的研究和作用機(jī)制的探索。五個(gè)松香烷型二萜化合物:52、57、54、55、56,均從昆明山海棠中分離獲得,其結(jié)構(gòu)具有相似性,均顯示出體外NO抑制活性。其中化合物52(tritophenolide)和57(triptoquinone)活性最為明顯,IC_(50)分別為21.4和2.58μM,進(jìn)一步采用ELISA法和Western Blot法對(duì)化合物的抗炎活性進(jìn)行確認(rèn)并探索其作用機(jī)制,結(jié)果顯示,在LPS活化的巨噬細(xì)胞中,兩個(gè)化合物都能抑制iNOS,COX-2蛋白的表達(dá)和炎癥因子NO,IL-1β,IL-6,TNF-α分泌,對(duì)信號(hào)通路影響研究發(fā)現(xiàn),化合物52可能主要下調(diào)MAPK(p-p38,p-JNK,p-ERK1/2)信號(hào)通路的活化,化合物57可能是同時(shí)抑制NF-κB(p-IκB)和MAPK兩條信號(hào)通路的活化,進(jìn)而抑制炎癥因子的分泌來達(dá)到抗炎作用。另外,從金剛纂中分離得到的巨大戟烷型二萜化合物27(euphorneroid E)和28(eurifoloid A)、松香烷型二萜化合物60(antiquorine A),阿替生烷型二萜化合物72(eurifoloid N),海松烷型二萜化合物64(sandaracopimaradiene-3),均表現(xiàn)出體外NO抑制活性,IC_(50)分別為6.31,5.78,22.7,37.1和19.0μM。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),在LPS活化的巨噬細(xì)胞中,化合物60,72,64能夠明顯的抑制炎癥因子IL-1β,IL-6,TNF-α和iNOS,COX-2蛋白表達(dá),可能是通過下調(diào)MAPKs信號(hào)通路的活化。另外兩個(gè)化合物27和28對(duì)IL-1β,IL-6和iNOS的表達(dá)體現(xiàn)明顯的抑制作用,然而對(duì)TNF-α和COX-2的表達(dá)體現(xiàn)較明顯的促進(jìn)作用,在信號(hào)通路方面明顯的下調(diào)MAPK/p38的活化,上調(diào)MAPK/erk的磷酸化水平,因此,化合物27,28作用機(jī)制需要我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285;R284
【圖文】：

圖 1-1 炎癥的原因，生理和病理結(jié)果Figure 1-1 Causes of inflammation, physiological and pathological results1.1.3 參與炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)炎癥過程就是可溶性因子與細(xì)胞相互作用復(fù)雜的一個(gè)過程。當(dāng)機(jī)體受到損傷或者病原體侵染時(shí)，體內(nèi)免疫系統(tǒng)就會(huì)開啟保護(hù)機(jī)制，大量的免疫細(xì)胞（immunocyte）包括 T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒和肥大細(xì)胞等會(huì)以滲出的形式到達(dá)損傷或感染部位，到達(dá)之后由致炎因素觸發(fā)激活免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，使細(xì)胞處于活化狀態(tài)[22]。致炎因素通常分為外源性和內(nèi)源性兩種，外源性致炎因素（Exogenous inducers）包括生物性和非生物性，生物性主要是指能夠引起機(jī)體感染的病毒、細(xì)菌、寄生蟲等；非生物性致炎因素是指過敏原、刺激、異物和有毒化合物。內(nèi)源性致炎因素（Endogenous inducers）包括細(xì)胞來源、組織來源、血漿來源和細(xì)胞外基質(zhì)來源[23]�；罨拿庖呒�(xì)胞會(huì)分泌大量的可溶性因子，包括致炎介質(zhì)（pro-inflammatorymediators）和抗炎介質(zhì)(anti-inflammatory mediators)。致炎介質(zhì)的是由專門白細(xì)胞

圖 1-2 免疫細(xì)胞和炎癥因子相互作用形成的信息流[10]Figure 1-2. Information flow of immune cells and inflammatory factors1.1.4 脂多糖誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路在細(xì)菌感染的炎癥中，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁表面的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是致炎性最強(qiáng)的內(nèi)毒素，能夠引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。LPS 是革蘭氏陰性菌胞壁組成成分，細(xì)菌死亡時(shí)釋放到胞外發(fā)揮作用，其結(jié)構(gòu)由 4 部分組成：具有毒力活性的類脂 A、多糖成分外核心、內(nèi)核心、O-特異側(cè)鏈。LPS 先和血清中的結(jié)合蛋白（LPS binding protein, LBP）結(jié)合，再與細(xì)胞膜上的各種受體相結(jié)合，例如，Toll 樣受體（toll like receptors, TLRs）[33-34]、CD14（cluster of differentiation 14）[35]和髓樣分化蛋白-2（myeloid differentiationa-2, MD-2）[36]，結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)一系列的蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使炎癥因子的產(chǎn)生，如 TNFα、IL-1β、IL-6 等。對(duì)于受感染的機(jī)體來說，一方面，炎癥因子可以誘導(dǎo)急性炎癥的發(fā)生，促使免疫細(xì)胞在感染部位聚集，從體內(nèi)清除病原體。另一方面， LPS 過度的刺激會(huì)促使

圖 1-3 巨噬細(xì)胞被激活時(shí)所涉及的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]ig. 1-3 Inflammatory signal transduction involved in activation of macrophaκB 信號(hào)通路 核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是錄因子家族，通過控制基因網(wǎng)絡(luò)表達(dá)在心血管生長、應(yīng)激反應(yīng)用。雖然 NF-κB 亞基廣泛表達(dá)，但它們的作用是以細(xì)胞類型節(jié)的，從而可以產(chǎn)生不同的效應(yīng)[44]。例如，紫外、細(xì)胞因子、壁的產(chǎn)物、血管升壓類藥物、病毒感染和DNA損傷都能夠激活κB 的激活被認(rèn)為是由兩個(gè)不同的途徑控制的，稱為 經(jīng)典‖和 ]。(1)經(jīng)典途徑。正常情況下，Rel A(p65)·NF-κB 通過與 IκBα失去與 DNA 結(jié)合和核轉(zhuǎn)位能力的復(fù)合體，游離在細(xì)胞質(zhì)中[4，TNF-α，IL-1）與膜受體結(jié)合后激活 IKK 復(fù)合體（包括 IKNEMO，IKAP，F(xiàn)IP）使 IKKα 和 β 磷酸化，重新游離到細(xì)胞

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2760753