【摘要】：目的熱痹清片是治療虛熱型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中成藥,方中含有制馬錢子。制馬錢子治療風(fēng)濕病的主要有效成分為馬錢子堿和士的寧,同時兩者也是毒性成分。實驗研究建立熱痹清片中馬錢子堿和士的寧的血藥濃度分析方法,并以制馬錢子粉為對照,研究其在大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)模型下及正常大鼠多次給藥的藥動學(xué)過程,以探討其體內(nèi)的藥動學(xué)規(guī)律,為熱痹清片在臨床上安全合理應(yīng)用和開展深入研究奠定基礎(chǔ)。方法1.熱痹清片中馬錢子堿和士的寧血藥濃度分析方法的建立。采用高靈敏度的超高液相色譜-四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(UPLC-Q-Orbitrap HRMS),以馬錢子堿、士的寧響應(yīng)值及峰形作為評價指標(biāo),以鹽酸克倫特羅為內(nèi)標(biāo),考察質(zhì)譜和色譜測定條件,優(yōu)選流動相的比例和進(jìn)樣時間,并進(jìn)行相關(guān)方法學(xué)考察。2.熱痹清片中馬錢子堿和士的寧在AA模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。(1)造模隨機(jī)取SD雄性大鼠36只,在其右后足注射弗氏完全佐劑0.1ml進(jìn)行造模,于造模后第1、3、5、8、10、12、14、15、16天測定各組大鼠足跖部腫脹體積、關(guān)節(jié)紅腫程度和體重,計算足趾腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、增重率,初步判斷造模是否成功。并在藥動學(xué)實驗取血完畢后,腹主動脈取血,酶聯(lián)免疫法測定血清中IL-1β、TNF-α含量,并取脾臟、胸腺,應(yīng)用SPSS17.0軟件分析免疫器官脾臟、胸腺指數(shù),再次驗證造模是否成功。(2)分組將造模成功的大鼠,隨機(jī)分為制馬錢子粉模型組、熱痹清片模型組,每組6只。另取健康SD雄性大鼠12只,隨機(jī)分為熱痹清片組、制馬錢子粉組作為對照。(3)給藥劑量與取血各組均按馬錢子堿0.12 mg/kg的劑量灌胃給藥。于給藥后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶靜脈采血。采用液質(zhì)法測定各給藥組大鼠體內(nèi)血漿中馬錢子堿和士的寧的濃度。(4)實驗數(shù)據(jù)處理方法采用DAS3.0軟件運算馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)參數(shù),SPSS17.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)的差異,進(jìn)行t檢驗分析。3.正常大鼠多次給予熱痹清片的藥動學(xué)研究。取SD雄性大鼠隨機(jī)12只,分為熱痹清片組、制馬錢子粉組,每組6只。按馬錢子堿0.12mg/kg的劑量灌胃給予相應(yīng)藥物,每天給藥三次,連續(xù)灌胃6天。自第三天起,每天于第二次灌胃后180、300、420min,分別對各組大鼠進(jìn)行眼眶靜脈取血。在第七天早上灌胃給藥后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶靜脈取血,應(yīng)用液質(zhì)法測定大鼠體血漿中馬錢子堿和士的寧的濃度,DAS3.0軟件計算馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)參數(shù)。SPSS17.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)的差異,進(jìn)行t檢驗分析。結(jié)果1.血藥濃度測定方法。質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源,選用正離子,sheath gas flow rate:10,spray voltage(KV):3.5,spray current(uA):0.3,capillary temperature(℃):320,Aux gas heater temperature:50。馬錢子堿、士的寧、鹽酸克倫特羅的m/z分別395.199、335.177、279.161。色譜條件:流動相30%乙腈:70%0.15%甲酸溶液,柱溫35℃,流速0.2mL/min,進(jìn)樣量5μL,進(jìn)樣時間5min。馬錢子堿和士的寧的線性范圍分別為0.12~15ng/mL、0.24~30.75ng/mL,兩者的平均回收率分別為84.93%、83.37%,RSD為6.06%,基質(zhì)效應(yīng)分別為84.92%、84.29%,RSD為3.01%。最低檢測限為:馬錢子堿0.06ng/mL,士的0.12ng/mL,兩者的RSD分別為4.78%,4.77%。2.熱痹清片中馬錢子堿和士的寧在AA大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。制馬錢子粉在正常大鼠與AA大鼠體內(nèi)馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)參數(shù)的平均數(shù)分別為:T_(max)為1.50、1.58h和0.32、0.28h;C_(max)為2.26、3.45ng/mL和3.45、21、47ng/mL;AUC為35.7、156.56和29.65、93.82 ng·min·L~(-1),T_(1/2)為6.58、6.92h和2.51、2.13h;CL/F為623339、65441L·kg~(-1)·min~(-1)和810118、823325L·kg~(-1)·min~(-1);熱痹清片在正常大鼠與AA大鼠體內(nèi)馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)參數(shù)的平均數(shù)分別為:T_(max)為1.50、1.50h和0.64、0.73h,C_(max)為2.68、7.16ng/mL和5.27、21.57ng/mL,AUC為16.52、148.42和52.4、175.02ng·min·L~(-1),T_(1/2)為4.70、5.63h和3.57、2.50h,CL/F為71250、81818 L·kg~(-1)·min~(-1)和91349、93217L·kg~(-1)·min~(-1)。AA大鼠體內(nèi)馬錢子堿和士的寧參數(shù)T_(1/2)提前1.13、3.13h,T_(max)提前0.86、0.77h,C_(max)是正常大鼠的1.96、3.01倍,CL/F是正常大鼠的1.28、1.13倍;馬錢子堿和士的寧在正常大鼠與AA大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程均符合一室模型。熱痹清片AA組和制馬錢子粉AA組之間,馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)參數(shù)AUC_(0-t),T_(max)有差異。3.正常大鼠多次給予熱痹清片的藥動學(xué)研究。熱痹清片中馬錢子堿和士的寧從第三天給藥后達(dá)到了穩(wěn)態(tài)。馬錢子堿和士的寧的血藥濃度維持在0.14~0.24 ng/mL,0.91~2.11ng/mL。馬錢子堿和士的寧在兩組大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程均符合一室模型。末次給予熱痹清片后馬錢子堿和士的寧在的主要藥動學(xué)參數(shù)分別:T_(max)分別為1.50、1.08h,C_(max)分別為4.46、18.74ng/ml,AUC_(0~t)分別為60.10、215.62ng·min·L~(-1),CL/F分別為88991、51352L·kg~(-1)·min~(-1);制馬錢子粉中馬錢子堿和士的寧的在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù):T_(max)分別為1.33、0.71h,C_(max)分別為3.82、15.27ng·ml~(-1),AUC_(0~t)分別為47.2、129.13ng·min·L~(-1),CL/F分別為56182、20408L·kg~(-1·)min~(-1)。結(jié)論1.本實驗建立的測定大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧含量分析方法,專屬性強(qiáng),靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定,可以作為制劑中馬錢子堿和士的寧的血藥濃度的含量測定。2.熱痹清片中馬錢子堿和士的寧的藥動學(xué)過程均符合一室模型,且兩者在AA模型下與正常大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)相比,熱痹清片中馬錢子堿和士的寧生物利用度增加、吸收增加、消除加快。制馬錢子粉AA組與熱痹清片AA組比較,馬錢子堿和士的寧達(dá)峰時間后延,吸收量增多。說明復(fù)方中其他藥味對其體內(nèi)過程有影響。3.正常大鼠多次給予熱痹清片,馬錢子堿和士的寧在第三天第二次給藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)。兩者的血藥濃度沒有隨著維持劑量的給藥次數(shù)的增加而疊加遞增,并且停止給藥后,二種成分在體內(nèi)能夠迅速消除,且末次給藥后兩者的藥動學(xué)行為均符合一室模型,提示該藥物在安全劑量內(nèi)幾乎不會造成體內(nèi)蓄積性中毒現(xiàn)象。制馬錢子粉和熱痹清片中馬錢子堿和士的寧藥動學(xué)參數(shù)有顯著差異,說明復(fù)方配伍對制馬錢子在大鼠體內(nèi)的過程有顯著影響。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

采用177、 高效.1 流實驗 1、用正離子峰鹽酸克倫效液相色譜流動相比例驗選擇乙腈-圖 2 。編號A圖 1.馬錢子峰，三者離子特羅：279譜條件的建立的選擇0.15%甲酸表 1乙腈（%）0.15水溶40F.內(nèi)標(biāo)采用子堿、士的寧子強(qiáng)度最高.161。立酸水溶液為流不同比例% 甲 酸溶液（%）60士的多個用負(fù)離子掃描寧、內(nèi)標(biāo)的分高時的 m/z 分流動相。不例流動相峰形峰形的寧、馬錢子個峰出現(xiàn)，描圖譜分子正負(fù)離子分別為馬錢不同比例流動形及保留時間子堿均有內(nèi)標(biāo)有裂子峰圖錢子堿：395動相峰形及結(jié)果保留時間馬錢子5.199、士及保留時間間子堿

結(jié)果5min、的含量.2 線性精密、3.758、3.8入上述定。以加權(quán)系0.1736馬錢子A.空白果顯示檢測1.23min、量分析時無干性關(guān)系密吸取適量的5、1.875、84、1.92、0述不同濃度的以馬錢子堿、系數(shù)進(jìn)行線669x-0.0049子堿和士的寧白血漿 B.空白血圖 4測到馬錢子1.62min，干擾物質(zhì)存的混合對照0.94、0.460.96、0.48、的對照品溶士的寧與線性回歸，91567，R2=寧分別在 0血漿中加對照品各血漿中馬錢堿、士的寧且在正常大存在。照品溶液 ，、0.23 、00.24 ng/m溶液，余按“內(nèi)標(biāo)峰面積分別得到馬=0.9930；士.12～15ng/品、內(nèi)標(biāo) C.正錢子堿和士的寧寧、內(nèi)標(biāo)物大鼠血漿和分別加入0.12ng/mLmL 的對照品“2.4”項下處積比值為 y馬錢子堿、士的寧：y=/mL、0.24～正常大鼠血漿寧的總離子流圖物鹽酸克倫和病理模型甲醇稀釋成，士的寧的品溶液。分處理血漿、值，以對照、士的寧的=0.25946-030.75ng/mD.AA 大鼠血漿倫特羅的保大鼠的血漿成馬錢子堿的濃度為 3別取大鼠血“2.3”項下色照品的濃度為的線性方程.0047241，mL 范圍內(nèi)有漿保留時間分漿中二種被堿的濃度為30.75、15.3血漿各 100色譜條件操為 x 值，以程。馬錢子R2=0.9892有良好的線分被3μ操以子2線

A.空白示檢測1.23min、析時無干關(guān)系取適量的1.875、、1.92、0同濃度的錢子堿、數(shù)進(jìn)行線9x-0.0049和士的寧5 、6。白血漿 B.空白血圖 4測到馬錢子1.62min，干擾物質(zhì)存的混合對照0.94、0.460.96、0.48、的對照品溶士的寧與線性回歸，91567，R2=寧分別在 0血漿中加對照品各血漿中馬錢堿、士的寧且在正常大存在。照品溶液 ，、0.23 、00.24 ng/m溶液，余按“內(nèi)標(biāo)峰面積分別得到馬=0.9930；士.12～15ng/品、內(nèi)標(biāo) C.正錢子堿和士的寧寧、內(nèi)標(biāo)物大鼠血漿和分別加入0.12ng/mLmL 的對照品“2.4”項下處積比值為 y馬錢子堿、士的寧：y=/mL、0.24～正常大鼠血漿寧的總離子流圖物鹽酸克倫和病理模型甲醇稀釋成，士的寧的品溶液。分處理血漿、值，以對照、士的寧的=0.25946-030.75ng/mD.AA 大鼠血漿倫特羅的保大鼠的血漿成馬錢子堿的濃度為 3別取大鼠血“2.3”項下色照品的濃度為的線性方程.0047241，mL 范圍內(nèi)有漿保留漿中堿的30.7血漿色譜為 程。R2有良

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：2758365