發(fā)布時間：2020-07-15 21:54

【摘要】：梅花鹿茸抗骨質(zhì)疏松膠囊(下文簡稱鹿茸膠囊)由鹿茸、葛根、補骨脂和黃瓜籽四味藥材組成,為控制其質(zhì)量,本試驗以16份藥品樣品以及4份陰性對照樣品作為試驗材料,從定性鑒別和定量分析兩個方面,對鹿茸膠囊進行分析和評價,并以補骨脂素和異補骨脂素作為指標性成分建立鹿茸膠囊的指紋圖譜,從而進一步完善和提高藥品的質(zhì)量標準,為實際生產(chǎn)和臨床應用提供科學依據(jù)。1、定性鑒別本試驗按照2015版《中華人民共和國藥典》中相關規(guī)定,并綜合有關文獻對各味藥材的鑒別方法,從供試品處理方法、薄層色譜條件、顯色條件以及點樣量等方面進行優(yōu)化,從而選擇出鑒別的最適方法。本試驗所用的鑒別方法具有專屬性強、簡便精確的特點。結果顯示鹿茸、葛根、補骨脂及黃瓜籽的色譜均條帶清晰、斑點明顯,與對照品在相同位置處有同顏色斑點,陰性對照無干擾,可列入鹿茸膠囊的質(zhì)量標準。根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》中的有關要求,以補骨脂素和異補骨脂素作為指標建立鹿茸膠囊的HPLC指紋圖譜。采用Agilent-C18(5μm,4.6×250mm)色譜柱;甲醇(A):水(B)梯度洗脫;檢測波長318 nm;柱溫;25℃;進樣量:10μL作為指紋圖譜的色譜條件,對16份樣品及4份陰性對照樣品進行指紋圖譜檢測,經(jīng)方法學考查證明該方法穩(wěn)定精確可靠。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)分析各樣品的HPLC色譜圖并對相似度進行評價,結果顯示1-16號樣品相似度均在0.8以上。2、定量分析利用高效液相色譜法(HPLC)檢測補骨脂素、異補骨脂素和葛根素含量;二喹啉甲酸法(BCA)檢測膠原蛋白含量;氨基酸自動分析儀檢測氨基酸含量;鈣、鋅、鐵利用原子吸收分光光度計檢測其含量;紫外分光光度計法測定多糖和磷的含量。補骨脂素和異補骨脂素的檢測:鹿茸膠囊甲醇超聲提取30min;甲醇-水梯度洗脫;檢測波長240nm。補骨脂素和異補骨脂素均在5~25μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關系;該方法重復性良好,RSD分別為1.15%、0.76%;加樣回收率分別為99.7%、100.7%。確定鹿茸膠囊中補骨脂素和異補骨脂素分別不得低于0.207mg/g、0.209mg/g。葛根素的檢測:鹿茸膠囊30%乙醇超聲提取30min;流動相:甲醇-水(25:75);檢測波長250 nm。葛根素在0.96~4.8μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關系;該方法重復性良好,RSD為2.01%;加樣回收率為98.4%。確定鹿茸膠囊中葛根素含量不得低于38.57μg/g。膠原蛋白的檢測:采用胰蛋白酶水解法從鹿茸膠囊中提取膠原蛋白,依次將牛血清蛋白標準品溶液、樣品溶液、陰性對照品溶液、BCA工作液點入96孔板中,利用酶標儀測定OD562nm值,膠原蛋白在0.5~10μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關系。確定鹿茸膠囊中的膠原蛋白含量不得低于29.73%。多糖的檢測:樣品中加入HCl溶液,沸水浴提取60min,NaOH溶液中和后加入DNS,沸水浴5min,紫外分光光度計檢測OD503nm值,得出總糖的含量。樣品經(jīng)85%乙醇回流提取3次,提取液回收乙醇,加DNS,沸水浴5min,紫外分光光度計測定OD520nm值,得出還原糖的含量。最后多糖=總糖-還原糖。總糖和還原糖含量在0.02~0.08mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系。確定鹿茸膠囊中的多糖含量不可低于8.79 mg/g。氨基酸的檢測:樣品加鹽酸,110℃水解22h。儀器條件:離子交換柱4.6mm×60mm、3μm磺酸型陽離子樹脂;柱溫57℃;反應溫度135℃;分離緩沖液流速0.40mL/min;茚三酮反應液流速0.35mL/min;波長570、440nm;分析時間30min。確定鹿茸膠囊中氨基酸的總量不得低于22.72%,必需氨基酸的總量不得低于10.88%。無機元素的檢測:樣品經(jīng)高氯酸+硝酸消解液消解后,利用原子吸收分光光度計檢測,鈣、鋅、鐵三種元素分別在4~20μg/mL、0.5~2μg/mL、2~8μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。再用紫外分光光度計測定OD660nm值,檢測磷的含量,磷含量在5~50μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系。確定鹿茸膠囊中鈣、磷、鋅、鐵四種元素的含量不得低于32.33%、6.39%、0.12mg/g、0.62 mg/g。各定量分析檢測方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復性,可用于對梅花鹿茸抗骨質(zhì)疏松膠囊中各成分的質(zhì)量控制。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R286.0
【圖文】：

圖 1.1 不同提取溶劑色譜圖Figure 1.1 Chromatograms of different extraction solvents由以上色譜圖能夠看出甲醇的提取效果均優(yōu)于乙醇，其中甲醇提取時所得色譜峰的分離度更好，峰高比例優(yōu)于 50%甲醇，選擇甲醇作為提取溶劑。1.2.5.5 提取方法的選擇稱取 1 號樣品 6 份，每份 1g，分別按照以下兩種方法制備樣品溶液：超聲法：將樣品放入錐形瓶中，加入 50mL 甲醇，分別超聲 15min，30min，60min 后 4500r·min-1條件下離心 5min，上清液經(jīng) 0.45μm 濾膜濾過，備用�；亓鞣ǎ簩悠贩湃胨魇咸崛∑鲀�(nèi)，加入甲醇 50mL，分別回流 30min，1h，2h 后同上法處理。分別吸取上述樣品溶液各 10μL，注入液相色譜儀中，結果見圖 1.2。

9圖 1.2 不同提取方法色譜圖Figure 1.2 Chromatograms of different extraction methods由以上色譜圖能夠看出超聲 15min 提取率較低，其余各方法所得色譜峰數(shù)量基本一致，超聲法操作更簡單易行，故采用超聲提取 30min。1.2.5.6 流動相的選擇精密稱取 1 號樣品 1g，按 1.6.2.3 項制備供試品溶液，注入液相色譜儀，分別采用甲醇-水，乙腈-水、甲醇-乙腈-水作為流動相，采用梯度洗脫，結果見圖1.3。

不同流動相色譜圖

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本文編號：2757061