【摘要】：研究背景:《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載“有人于此,并行并立,其年長少等也,衣之厚薄均也,卒然遇烈風暴雨,或病或不病或皆病,或皆不病”,其含義為面對相同致病外因,不同個體的臨床癥狀表現(xiàn)為不發(fā)病或輕、重、緩、急等不盡相同,表明個體間存在“疾病易感性”的差異。即使是同一個基因型的個體,在不同的情緒狀態(tài),面對同樣致病因素的“疾病易感性”也不同。近年來,隨著生活水平的提高,高脂和高能飲食成為了當前一種難以避免的生活方式,非酒精性脂肪肝病(NAFLD)也因此成為當前危害人民健康的主要疾病之一。傳統(tǒng)中醫(yī)認為“肝郁則脾虛”,即認為情志抑滯不暢則會導致機體代謝功能異常,提示情志應激可能會增加NAFLD的“易感性”。流行病學調(diào)查也發(fā)現(xiàn)工作壓力或情志應激增加高脂飲食(HFD)人群NAFLD的發(fā)生和發(fā)展,基礎研究中也觀察到應激負荷加重動物NAFLD表型的現(xiàn)象。這些傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代研究均提示情志應激能增加NAFLD的“易感性”,然而其“易感”機制尚不清楚。研究目的:本研究采用情志應激附加HFD喂養(yǎng)的方式建立體內(nèi)和體外NAFLD“易感”模型,探討情志應激增加NAFLD“易感性”的機制,并利用建立的模型評價Camellia assamica Var.kucha來源嘌呤生物堿theacrine的保護作用及探討它的作用機制。研究方法:本研究以拘束應激或皮質(zhì)酮(CORT)負荷7周附加HFD喂養(yǎng)14周的方式誘導小鼠產(chǎn)生NAFLD模擬情志應激誘發(fā)的NAFLD,并在體外采用皮質(zhì)醇(CS)附加油酸(oleate)負荷的方式誘導肝細胞產(chǎn)生脂肪變性來模擬情志應激易感的NAFLD模型。本研究進行肝臟組織學觀察,檢測脂酰肉堿以及脂肪酸代謝相關(guān)基因及蛋白等。隨后,本研究在情志應激易感的NAFLD模型上給予theacrine干預并檢測脂肪酸代謝及藥效指標。此外,本研究利用HFD喂養(yǎng)14周誘導小鼠NAFLD模型以及采用oleate誘導體外脂肪肝細胞模型探究theacrine改善脂酰肉堿代謝的深入機制。此外,本研究通過代謝流分析和基因沉默技術(shù)確證theacrine調(diào)控脂酰肉堿代謝的機制。研究結(jié)果:拘束應激明顯增加HFD誘導ApoE-/-小鼠的肝脂肪變性、炎癥和纖維化程度,導致脂酰肉堿代謝紊亂,提示了情志應激增加NAFLD的“易感性”,并可能與拘束應激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸分泌過量血漿CORT相關(guān)。通過給予與拘束應激產(chǎn)生當量CORT的2 mg/kg CORT后,CORT處理的NAFLD小鼠與拘束應激易感的NAFLD模型具有相似表型,如大泡型脂肪變性、甘油三酯及脂肪酸堆積、線粒體蛋白過度乙�；�。進一步機制研究發(fā)現(xiàn),情志應激誘導的CORT促進糖皮質(zhì)激素受體(GR)過度轉(zhuǎn)位進入細胞核抑制去乙�；窼irtuin 3(SIRT3)/長鏈脂酰輔酶A脫氫酶(LCAD)信號通路功能,上調(diào)脂滴包被基因PLIN2的表達促進脂肪分化相關(guān)蛋白(ADFP)表達;促進GR轉(zhuǎn)位到脂滴膜上與ADFP發(fā)生相互作用募集ADFP。阻斷GR受體則抑制大泡型脂肪變性、恢復SIRT3/LCAD信號通路功能、抑制ADFP表達以及減少ADFP募集到脂滴膜上。另外,CS抑制Hep G2細胞內(nèi)脂酰肉堿代謝;CS與oleate共同處理則導致細胞內(nèi)脂肪變性加重、SIRT3活性下調(diào),提示情志應激易感的NAFLD體外模型建立成功。在細胞過表達SIRT3后,CS易感NAFLD細胞模型的脂肪變性得到改善,提示了SIRT3在情志應激誘導NAFLD“易感”機制中起到關(guān)鍵作用。此外,本研究評價出theacrine具有促進脂酰肉堿代謝及激活SIRT3/LCAD信號通路的作用,并且在已建立的3個情志應激易感的NAFLD模型上發(fā)現(xiàn)theacrine對大泡型脂肪變性、纖維化等具有明顯的改善作用。再之,theacrine對單純HFD誘導的NAFLD及oleate誘導的體外脂肪肝也具有改善作用,并且通過促進脂肪酸氧化、抑制脂肪酸的延伸及去飽和進而抑制長鏈脂酰肉堿堆積。在深入的機制上,本研究發(fā)現(xiàn)theacrine靶向與SIRT3結(jié)合或上調(diào)SIRT3的表達進而激活其去乙�；钚栽鰪奓CAD活性,進而促進脂酰肉堿代謝。研究結(jié)論:本研究闡明了情志應激增加NAFLD“易感性”機制與GC促進GR轉(zhuǎn)位至細胞核下調(diào)SIRT3/LCAD/脂酰肉堿代謝功能及增加ADFP堆積促進脂滴生成有關(guān)。Theacrine能改善情志應激易感的NAFLD,同時對單純HFD誘導NAFLD也具有效用。該結(jié)果為theacrine開發(fā)成為情志應激易感NAFLD及肝郁脾虛分型NAFLD的治療藥物提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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