發(fā)布時間：2020-07-15 14:09

【摘要】：成人急性淋巴細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)約占成人急性白血病的20%-30%1,ALL細胞對常規(guī)化療藥物的耐藥是導致成人ALL患者療效不佳的重要原因2。因此,深入研究ALL細胞對常規(guī)化療藥物的耐藥機制以及尋找有效藥物逆轉其耐藥成為成人ALL治療迫切需要解決的問題。目的:探討低濃度雷公藤甲素(triptolide,TPL)能否逆轉ALL對阿糖胞苷(cytarabine,arac)的耐藥,并進一步研究其逆轉耐藥的機制,為難治/復發(fā)(relapsed or refractory,R/R)成人ALL患者提供治療選擇。方法:1.通過濃度遞增的方法建立對arac耐藥的ALL細胞株NALM-6/R,同時收集臨床難治/復發(fā)原代ALL細胞作為本研究的研究對象,2.觀察IC20濃度的TPL聯(lián)合arac對耐藥ALL細胞的增殖抑制和誘導凋亡的作用;3.通過建立耐藥細胞株動物模型,進一步驗證IC20的TPL聯(lián)合arac體內殺傷耐藥ALL的能力。4.采用western blotting、流式細胞術等方法檢測DNA損傷修復相關蛋白變化,探討TPL逆轉ALL耐藥的可能機制。結果:1.建立了對5 μMarac耐藥的NALM-6/R細胞株,同時其獲得對0.5 μM阿霉素(ADM)的交叉耐藥。2.IC20 的 TPL 聯(lián)合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 NALM-6/R 48h 的 IC50 值分別為:2.25 ± 0.72(TPL+arac)、0.32 ± 0.081(TPL+arac),較單藥 arac、ADM分別逆轉耐藥 20、15.16 倍(p0.01)。IC20 的 TPL 聯(lián)合5μ M arac 或 0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后細胞凋亡比例分別為52.40 ± 4.45%和24.60 ± 3.23%,較單藥 5μM arac(10.21±0.07%)和 0.5μMADM(5.56±0.04%)明顯增強(p0.01)。IC20 的 TPL 聯(lián)合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 12 例 R/R 原代 ALL 細胞48h后凋亡細胞比例分別為53.51±12.44%、51.50±15.44%,較單藥5μM arac(40.87±5.73%)和 0.5μMADM(42.23±9.92%)同樣明顯增強(p0.01)。進一步根據(jù)復發(fā)和(或)難治時的WBC進行分組分析:WBC≥100×109/L組細胞凋亡比例高于 WBC100×109/L 組,TPL+arac 組分別為:61.36±10.12、42.52±3.61(p0.05);TPL+ADM 組分別為:59.67±15.12、40.08±5.72(p0.05)。3.動物模型接受TPL+arac治療5天,其外周血、骨髓組織切片腫瘤細胞均較單藥組明顯下降,且聯(lián)合治療組脾臟重量0.17 ±0.26 g,較ddH2O、arac和TPL組降低,分別為:0.31± 0.23 g、0.28 ±0.01g 和0.33 ±0.56 g(p0.0001)。此外,聯(lián)合治療組生存時間較對照組和單藥治療組明顯延長(p=0.002)。4.IC20的TPL聯(lián)合5μM arac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h線粒體膜電位去極化細胞比例53.8 ±1.23%、51.8 ±0.79%,較單藥5μM arac(15.2 ±0.76%)和0.5μMADM(20.5±0.37%)明顯下降(p0.001)。IC20 的TPL聯(lián)合5μMarac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后ROS水平較單藥5 μM arac、0.5νM ADM 提高9倍和5倍;經(jīng)ROS清除劑NAC預處理NALM-6/R2h,不僅降低聯(lián)合處理所致的ROS水平,而且凋亡細胞比例明顯降低,分別為24.60 ±3.23%、14.15 ±2.41%(p0.001)。采用FACS及Western blotting方法檢測DNA損傷標志及修復相關蛋白。結果表明,較單藥組,聯(lián)合處理后增加了 γ-H2AX和Caspase9表達,相反DNA修復相關蛋白pChk1、pChk2的水平明顯降低。結論:本研究證實IC20的TPL具有體內外逆轉ALL多藥耐藥的作用。其機制可能是通過誘導ROS產(chǎn)生,增強DNA損傷、抑制DNA修復相關蛋白,從而啟動細胞內凋亡通路,促進細胞凋亡。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

４５．００士３．２７邋（ｎＭ）和４．８５士０．９５邋（ｎＭ）下降到聯(lián)合后的２．２５±０．７２邋（ｎＭ）和０．３２±０．０８１逡逑（ｎＭ），逆轉耐藥倍數(shù)分別為２０．００和１５．１６，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義（Ｐ＜０．０１）逡逑（表邋１－２，圖１－１）。逡逑２０逡逑

相比ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ和ＴＰＬ組，接受ＴＰＬ＋邋ａｒａｃ治療組外周血人源性逡逑ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞比例明顯下降；在骨髓組織切片水平，也顯示一致性結果，見逡逑圖２－１，２－２，邋２－３。不僅如此，接受ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療組脾臟重量０．１７邋±０．２６邋ｇ，較逡逑ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ邋和邋ＴＰＬ邋組降低，分別為：０．３１邋±邋０．２３邋ｇ、０．２８邋±邋０．０１邋ｇ邋和邋０．３３邋士逡逑０．５６邋ｇ，差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜邋０．０００１），見圖２－４。逡逑ａ逡逑？／邋�。�？－１邐，？？邋ＨＩＦ＂邐？ｖ逡逑＇■：邐－；逡逑，ｅ，？＊＇邐？逡逑’’邋ｍ邋．二－Ｉ邐＇＊邋Ｔ逡逑ｉｓｏｔｙｐｅ邐ｄｄＨ２０逡逑ｍ逡逑％邐３邋－邐５邋４０％．邐＃？邐？？邐Ｉ逡逑８邋．．邋，，邋，■逡逑；？＇邐＾邐

Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＴＰＬ邋ａｒａＣ邋ＴＰＬ＋ａｒａＣ逡逑圖２－２：采用流式細胞技術檢測，分別接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療５逡逑天后，外周血人源性ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞比例柱狀圖（＊：與對照組及單藥治療組相逡逑比，差異具有統(tǒng)計學差異，ＰＣ０．００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２．邋Ａ邋ｃｏｌｕｍｎ邋ｃｈａｒｔ邋ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ邋ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｒａｔｉｏｓ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋％邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｄｒｕｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ邋ａｓ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ邋ａｂｏｖｅ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｒｄ邋（ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ）．邋（＊：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋，ＴＰＬ逡逑ｏｒ邋ａｒａｃ邋ｇｒｏｕｐ，Ｐ＜０．００１）逡逑ｂ邐ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＡｒａＣ逡逑灥灥逡逑ＴＰＬ邐ＴＰＬ＋ＡｒａＣ逡逑圖２－３：骨髓組織Ｈ＆Ｅ染色顯示，分別接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療逡逑５天，骨髓組織內腫瘤細胞密度差異逡逑３４逡逑

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本文編號：2756594