【摘要】：成人急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)約占成人急性白血病的20%-30%1,ALL細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥是導(dǎo)致成人ALL患者療效不佳的重要原因2。因此,深入研究ALL細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥機(jī)制以及尋找有效藥物逆轉(zhuǎn)其耐藥成為成人ALL治療迫切需要解決的問(wèn)題。目的:探討低濃度雷公藤甲素(triptolide,TPL)能否逆轉(zhuǎn)ALL對(duì)阿糖胞苷(cytarabine,arac)的耐藥,并進(jìn)一步研究其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制,為難治/復(fù)發(fā)(relapsed or refractory,R/R)成人ALL患者提供治療選擇。方法:1.通過(guò)濃度遞增的方法建立對(duì)arac耐藥的ALL細(xì)胞株NALM-6/R,同時(shí)收集臨床難治/復(fù)發(fā)原代ALL細(xì)胞作為本研究的研究對(duì)象,2.觀察IC20濃度的TPL聯(lián)合arac對(duì)耐藥ALL細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用;3.通過(guò)建立耐藥細(xì)胞株動(dòng)物模型,進(jìn)一步驗(yàn)證IC20的TPL聯(lián)合arac體內(nèi)殺傷耐藥ALL的能力。4.采用western blotting、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白變化,探討TPL逆轉(zhuǎn)ALL耐藥的可能機(jī)制。結(jié)果:1.建立了對(duì)5 μMarac耐藥的NALM-6/R細(xì)胞株,同時(shí)其獲得對(duì)0.5 μM阿霉素(ADM)的交叉耐藥。2.IC20 的 TPL 聯(lián)合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 NALM-6/R 48h 的 IC50 值分別為:2.25 ± 0.72(TPL+arac)、0.32 ± 0.081(TPL+arac),較單藥 arac、ADM分別逆轉(zhuǎn)耐藥 20、15.16 倍(p0.01)。IC20 的 TPL 聯(lián)合5μ M arac 或 0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后細(xì)胞凋亡比例分別為52.40 ± 4.45%和24.60 ± 3.23%,較單藥 5μM arac(10.21±0.07%)和 0.5μMADM(5.56±0.04%)明顯增強(qiáng)(p0.01)。IC20 的 TPL 聯(lián)合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 12 例 R/R 原代 ALL 細(xì)胞48h后凋亡細(xì)胞比例分別為53.51±12.44%、51.50±15.44%,較單藥5μM arac(40.87±5.73%)和 0.5μMADM(42.23±9.92%)同樣明顯增強(qiáng)(p0.01)。進(jìn)一步根據(jù)復(fù)發(fā)和(或)難治時(shí)的WBC進(jìn)行分組分析:WBC≥100×109/L組細(xì)胞凋亡比例高于 WBC100×109/L 組,TPL+arac 組分別為:61.36±10.12、42.52±3.61(p0.05);TPL+ADM 組分別為:59.67±15.12、40.08±5.72(p0.05)。3.動(dòng)物模型接受TPL+arac治療5天,其外周血、骨髓組織切片腫瘤細(xì)胞均較單藥組明顯下降,且聯(lián)合治療組脾臟重量0.17 ±0.26 g,較ddH2O、arac和TPL組降低,分別為:0.31± 0.23 g、0.28 ±0.01g 和0.33 ±0.56 g(p0.0001)。此外,聯(lián)合治療組生存時(shí)間較對(duì)照組和單藥治療組明顯延長(zhǎng)(p=0.002)。4.IC20的TPL聯(lián)合5μM arac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h線粒體膜電位去極化細(xì)胞比例53.8 ±1.23%、51.8 ±0.79%,較單藥5μM arac(15.2 ±0.76%)和0.5μMADM(20.5±0.37%)明顯下降(p0.001)。IC20 的TPL聯(lián)合5μMarac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后ROS水平較單藥5 μM arac、0.5νM ADM 提高9倍和5倍;經(jīng)ROS清除劑NAC預(yù)處理NALM-6/R2h,不僅降低聯(lián)合處理所致的ROS水平,而且凋亡細(xì)胞比例明顯降低,分別為24.60 ±3.23%、14.15 ±2.41%(p0.001)。采用FACS及Western blotting方法檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志及修復(fù)相關(guān)蛋白。結(jié)果表明,較單藥組,聯(lián)合處理后增加了 γ-H2AX和Caspase9表達(dá),相反DNA修復(fù)相關(guān)蛋白pChk1、pChk2的水平明顯降低。結(jié)論:本研究證實(shí)IC20的TPL具有體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)ALL多藥耐藥的作用。其機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,增強(qiáng)DNA損傷、抑制DNA修復(fù)相關(guān)蛋白,從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

４５．００士３．２７邋（ｎＭ）和４．８５士０．９５邋（ｎＭ）下降到聯(lián)合后的２．２５±０．７２邋（ｎＭ）和０．３２±０．０８１逡逑（ｎＭ），逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)分別為２０．００和１５．１６，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．０１）逡逑（表邋１－２，圖１－１）。逡逑２０逡逑

相比ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ和ＴＰＬ組，接受ＴＰＬ＋邋ａｒａｃ治療組外周血人源性逡逑ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細(xì)胞比例明顯下降；在骨髓組織切片水平，也顯示一致性結(jié)果，見(jiàn)逡逑圖２－１，２－２，邋２－３。不僅如此，接受ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療組脾臟重量０．１７邋±０．２６邋ｇ，較逡逑ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ邋和邋ＴＰＬ邋組降低，分別為：０．３１邋±邋０．２３邋ｇ、０．２８邋±邋０．０１邋ｇ邋和邋０．３３邋士逡逑０．５６邋ｇ，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜邋０．０００１），見(jiàn)圖２－４。逡逑ａ逡逑？／邋！－？－１邐，？？邋ＨＩＦ＂邐？ｖ逡逑＇■：邐－；逡逑，ｅ，？＊＇邐？逡逑’’邋ｍ邋．二－Ｉ邐＇＊邋Ｔ逡逑ｉｓｏｔｙｐｅ邐ｄｄＨ２０逡逑ｍ逡逑％邐３邋－邐５邋４０％．邐＃？邐？？邐Ｉ逡逑８邋．．邋，，邋，■逡逑；？＇邐＾邐

Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＴＰＬ邋ａｒａＣ邋ＴＰＬ＋ａｒａＣ逡逑圖２－２：采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，分別接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療５逡逑天后，外周血人源性ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細(xì)胞比例柱狀圖（＊：與對(duì)照組及單藥治療組相逡逑比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ＰＣ０．００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２．邋Ａ邋ｃｏｌｕｍｎ邋ｃｈａｒｔ邋ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ邋ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｒａｔｉｏｓ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋％邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｄｒｕｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ邋ａｓ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ邋ａｂｏｖｅ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｒｄ邋（ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ）．邋（＊：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋，ＴＰＬ逡逑ｏｒ邋ａｒａｃ邋ｇｒｏｕｐ，Ｐ＜０．００１）逡逑ｂ邐ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＡｒａＣ逡逑灥灥逡逑ＴＰＬ邐ＴＰＬ＋ＡｒａＣ逡逑圖２－３：骨髓組織Ｈ＆Ｅ染色顯示，分別接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治療逡逑５天，骨髓組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞密度差異逡逑３４逡逑

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本文編號(hào)：2756594