【摘要】：目的:探討槲皮素對(duì)肝脂肪變性中線粒體穩(wěn)態(tài)及線粒體自噬失衡的保護(hù)效應(yīng),以及Frataxin對(duì)PINK1-Parkin線粒體自噬信號(hào)通路的介導(dǎo)機(jī)制。方法:48只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成低脂對(duì)照組(LFD,10%脂肪供能)、高脂模型組(HFD,60%脂肪供能)、槲皮素干預(yù)組(HFD+Q,100 mg/kg·bw)和槲皮素對(duì)照組(LFD+Q,100 mg/kg·bw),喂養(yǎng)10周后觀察小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況及血脂水平;qRT-PCR測(cè)定肝臟脂質(zhì)代謝及線粒體融合、分裂、生物合成和線粒體自噬相關(guān)基因表達(dá);透射電鏡觀察肝線粒體超微結(jié)構(gòu)與自噬狀態(tài)的變化;Western blot測(cè)定肝線粒體自噬相關(guān)通路蛋白的表達(dá),免疫熒光染色觀察Parkin的線粒體轉(zhuǎn)位。針對(duì)FXN基因設(shè)計(jì)和篩選寡核苷酸干擾序列,制備慢病毒載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞(Lv-FXN-mcherry)和空載體(Lv-mcherry),經(jīng)游離脂肪酸(FFAs,2 mmol/L,油酸㑳棕櫚酸=2㑳1)和槲皮素(100μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理24 h(同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照),比較各組細(xì)胞的脂質(zhì)沉積水平及Frataxin、PINK1、Parkin表達(dá)的變化,激光共聚焦檢查自噬小體與線粒體的共定位和Parkin的線粒體轉(zhuǎn)位。在此基礎(chǔ)上,利用p53抑制劑PFT-α和HIF-1α抑制劑PX-478處理HepG2細(xì)胞,觀察上述指標(biāo)的變化。結(jié)果:與LFD相比,10周的高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致血清甘油三酯與總膽固醇水平明顯升高,肝臟脂肪沉積尤為明顯,肝臟脂肪酸合成酶(FAS)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA水平升高(P0.05);肝線粒體結(jié)構(gòu)改變,膜電位和呼吸控制率下降(P0.05),部分肝線粒體生成相關(guān)基因表達(dá)下降(P0.05),線粒體融合及分裂相關(guān)基因均表達(dá)下降(P0.05);肝LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Frataxin的蛋白水平顯著下降(P0.05),p62蛋白表達(dá)上升(P0.05),肝線粒體上Parkin和LC3Ⅱ的表達(dá)顯著下降(P0.05),Parkin與VDAC1的共定位減少。經(jīng)槲皮素干預(yù)后,小鼠血脂與肝臟脂肪沉積有了明顯改善,FAS基因表達(dá)降低(P0.05),但SREBP-1c進(jìn)一步升高(P0.05);肝線粒體形態(tài)正常,膜電位和呼吸控制率上升(P0.05),肝線粒體生成相關(guān)基因、線粒體融合蛋白1及線粒體分裂蛋白1基因表達(dá)均上升(P0.05);肝LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1、Parkin和Frataxin的蛋白水平表達(dá)增加(P0.05),p62蛋白表達(dá)下降(P0.05),肝線粒體上Parkin和LC3Ⅱ的蛋白水平上調(diào)(P0.05),Parkin與VDAC1的共定位增加。在HepG2細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,FFAs處理組細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴蓄積,Frataxin表達(dá)降低(P0.05),PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬被抑制,Parkin與VDAC1、TOM20與LC3的共定位區(qū)域減少;槲皮素干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)上述改變,上調(diào)Frataxin的蛋白水平(P0.05)。Lv-FXN-mcherry細(xì)胞中,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)較Lv-mcherry細(xì)胞均表達(dá)下降(P0.05)。在FFAs處理下,與Lv-mcherry細(xì)胞相比,Lv-FXN-mcherry細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積明顯,TG水平上升(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P0.05);槲皮素干預(yù)后,Lv-FXN-mcherry細(xì)胞內(nèi)TG水平下降,PINK1和Frataxin表達(dá)增加(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和Parkin蛋白無(wú)顯著差異(P0.05)。HepG2細(xì)胞中,p53的抑制劑PFT-α可抑制Frataxin的表達(dá)(P0.05),在FFAs和PFT-α的共處理下,Frataxin進(jìn)一步降低(P0.05),而此時(shí)槲皮素對(duì)Frataxin的水平無(wú)顯著影響(P0.05)。結(jié)論:Frataxin介導(dǎo)了肝脂肪變性中PINK1-Parkin線粒體自噬,槲皮素能上調(diào)線粒體蛋白Frataxin的表達(dá),激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬,從而維持線粒體的正常穩(wěn)態(tài),緩解肝脂肪變性及脂質(zhì)代謝紊亂。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2755492