【摘要】：腸道病毒71(EV71)感染后,會引起機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng),其中自然殺傷細(xì)胞引起的固有免疫就是第一道防線。在本研究中,通過流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)(CBA)方法檢測EV71感染后手足口病患者NK細(xì)胞亞群以及細(xì)胞因子變化情況;另外,許多研究表明,白藜蘆醇(Res)具有多種生物學(xué)功能,如心血管保護(hù)、突變治療、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤等。本研究中通過RES被用于保護(hù)橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞免受EV71損傷,進(jìn)而對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討。研究表明,EV71感染后,NK細(xì)胞亞群中NKG2A+較正常對照組明顯升高,細(xì)胞因子(IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a)在手足口病患者中明顯升高。RES抗EV71病毒作用的研究中發(fā)現(xiàn),VP1蛋白在加入RES的實(shí)驗(yàn)組中分泌明顯減少;RES功能實(shí)現(xiàn)的一個(gè)前瞻性機(jī)制是,RES可能抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Perk/EIF2α/ATF4信號通路,下調(diào)自噬途徑,抵抗EV71誘導(dǎo)的RD細(xì)胞損傷。此外,RES治療顯著抑制了EV71感染引起的分泌性炎癥因子,如IL-6、IL-10和TNF-α。同時(shí),氧化應(yīng)激抑制劑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)抑制劑或自噬抑制劑阻斷了RES對EV71感染的RD細(xì)胞的抗病毒作用。這些結(jié)果表明,RES通過抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ERS/自噬信號通路,減弱了EV71誘導(dǎo)的病毒復(fù)制和炎癥效應(yīng)。第一部分:EV71感染后NK細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測目的:研究手足口病病人與健康對照者之間NK細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的變化情況。方法:收集吉林大學(xué)第一醫(yī)院2016年7月至2017年9月門診及住院病人70人,16名健康對照者標(biāo)本來自長春市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心學(xué)齡前健康體檢兒童。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞亞群變化,細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)(CBA)檢測細(xì)胞因子變化。結(jié)果:NKG2A~+CD3~-CD16~+CD56~+細(xì)胞亞群病人組較正常對照組比例明顯升高,細(xì)胞因子(IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a)在病人組較正常對照組明顯升高。以上結(jié)果通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:手足口病患兒急性期檢測NK細(xì)胞亞群NKG2A~+明顯升高,同時(shí),細(xì)胞因子IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a明顯升高,以上指標(biāo)可作為EV71感染后炎癥標(biāo)志物。第二部分:白藜蘆醇抗腸道病毒71的機(jī)制目的:建立EV71感染的RD細(xì)胞模型,進(jìn)一步明確RES的抗EV71作用相關(guān)的機(jī)制。方法:采用免疫熒光法檢測RES對EV71感染RD細(xì)胞內(nèi)的ROS生成的影響,通過試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)MDA及SOD水平,用免疫印跡法及免疫熒光法測定細(xì)胞內(nèi)VP1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),用Millipex磁珠和flexmap3d測定感染EV71的RD細(xì)胞中IL-6、IL-10和TNF-α的濃度。結(jié)果:免疫熒光法檢測結(jié)果示,EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制。試劑盒測定結(jié)果顯示,EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯增加且SOD水平明顯降低,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制。免疫印跡法結(jié)果示,(1)EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制,預(yù)處理氧化應(yīng)激抑制劑可顯著阻斷RES的作用;(2)EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制,預(yù)處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可顯著阻斷RES的作用;(3)EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)VP1表達(dá)明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制,預(yù)處理氧化應(yīng)激抑制劑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑及自噬抑制劑可顯著阻斷RES的作用。細(xì)胞因子檢測結(jié)果示,EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制,預(yù)處理氧化應(yīng)激抑制劑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑及自噬抑制劑可顯著阻斷RES的作用。免疫熒光法結(jié)果示,EV71感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加,此現(xiàn)象可被RES顯著抑制。結(jié)論:RES通過阻斷氧化應(yīng)激介導(dǎo)的ERS/自噬途徑發(fā)揮抗病毒作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

吉 林 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文IG-I 通過 5-三磷酸鹽識別短鏈雙鏈 RNA 和單鏈 RNA；而 MDA5 識別長雙鏈 RNA[19]；NLRP 分子能夠募集 CARD 接頭蛋白 ASC 等分子，進(jìn)一活化激活前半胱天冬酶-1（caspase-1）和誘導(dǎo) caspase-1 自我裂解，從而與 IL-1、IL-18 和 IL-33 等重要炎癥細(xì)胞因子的生成和剪切[20，21]。總之，Vs 不同種屬通過活化不同 PRRs 信號通路中的分子，從而刺激宿主天然疫反應(yīng)。

如圖 2.1�；颊呖沙霈F(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥（無菌性腦膜炎、腦炎、腦髓炎、遲緩性癱瘓、自主神經(jīng)失調(diào)），或者心肺并發(fā)癥（肺水腫、肺出或循環(huán)呼吸衰竭），或者兩者都有。采集后的全血置于 4℃冰箱，健康照的16份標(biāo)本置于干冰中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞提取

透腥競?NK 細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子變化的研究29圖 2.2 細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖2.2.6.3 混合人 Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子捕獲微球（1）確定實(shí)驗(yàn)管數(shù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品和對照管），并計(jì)算每種捕獲微球的實(shí)際需要量。吸取每種捕獲微球前需充分渦旋 3-5 秒，以確保混合液中的微球數(shù)量足夠；（2）離心混合好的捕獲微球，200g /5min，棄上清；（3）加入與棄掉上清等體積的血清增強(qiáng)緩沖液，充分渦旋混勻，并室溫避光孵育 30min。2.2.6.4 實(shí)驗(yàn)步驟（1）渦旋混合捕獲微球，所有的待檢管都加入 50ul，每加 5 管混勻一次；（2）S1-S10 標(biāo)

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本文編號：2754611