【摘要】：研究背景:骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)又稱(chēng)退行性骨關(guān)節(jié)病,是最常見(jiàn)的一種關(guān)節(jié)紊亂性疾病,在世界范圍內(nèi)影響著成千上萬(wàn)的患者,在中老年人群中尤為多見(jiàn)。有報(bào)道指出,到2020年,美國(guó)骨關(guān)節(jié)炎人口將達(dá)到5000萬(wàn)人,占成年人人口的25%。據(jù)2018年中華骨科雜志發(fā)布的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》統(tǒng)計(jì),我國(guó)65歲以上人群50%以上為骨關(guān)節(jié)炎患者,累及的部位包括髖、膝、踝、手及頸腰椎等關(guān)節(jié),我國(guó)膝關(guān)節(jié)癥狀性骨關(guān)節(jié)炎患病率達(dá)到8.1%,而且隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)展的加速,骨關(guān)節(jié)炎的患病率還有逐漸增高的趨勢(shì),嚴(yán)重影響中老年人的健康與生活質(zhì)量,給我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎病變主要是在生物學(xué)與力學(xué)因素共同作用下破壞軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及軟骨下骨合成與降解的平衡,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變纖維化、軟骨下骨硬化、周?chē)琴|(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄以及滑膜炎等,其中最重要環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退變。許多研究證實(shí)IL-1β能夠阻斷軟骨細(xì)胞在ECM成分中合成,干擾關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的合成,如Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖。軟骨細(xì)胞受到IL-1β刺激后,往往迅速衰老或逐漸凋亡,可以觀察到IL-1β對(duì)軟骨有多方面影響,包括抑制其修復(fù)的可能性、通過(guò)酶加速軟骨退化和直接對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生副作用,因此IL-1β被廣泛應(yīng)用作為誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的體外模型�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類(lèi)酶活性依賴(lài)于鋅離子的中性蛋白酶超家族。在關(guān)節(jié)軟骨破壞中起重要作用的主要是MMP-3、MMP-9和MMP-13,它們主要是由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌,它們均參與了破壞軟骨基質(zhì),致使膠原暴露于破壞膠原的酶并激活酶的活性,導(dǎo)致膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞,最后使其破裂分解。Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)和聚蛋白多糖(Aggrecan)是軟骨基質(zhì)中主要成分,其表達(dá)和凋亡可以作為反應(yīng)軟骨退變程度的指標(biāo),其活性的降低將導(dǎo)致ECM再生紊亂,最終導(dǎo)致軟骨退化。SDF-1是由滑膜產(chǎn)生,而CXCR4主要由關(guān)節(jié)軟骨表達(dá)。最近的研究明確表明SDF-1/CXCR4信號(hào)在OA的病變過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。體外研究表明,SDF1和CXCR4相互作用是通過(guò)上調(diào)MMPs表達(dá)刺激了人類(lèi)軟骨細(xì)胞的分解代謝活動(dòng)。有實(shí)驗(yàn)表明在OA患者滑液中的SDF-1水平出現(xiàn)升高,但可以通過(guò)滑膜切除手術(shù)減少其表達(dá),這進(jìn)一步證實(shí)了 SDF-1/CXCR4參與了 OA的進(jìn)展,也有學(xué)者通過(guò)基因操作或藥理阻斷下調(diào)SDF-1/CXCR4表達(dá),在體外能強(qiáng)有力的減弱人軟骨細(xì)胞的ECM退化,并能改善動(dòng)物模型中OA,這些研究結(jié)果表明,SDF-1是通過(guò)刺激MMPs表達(dá)來(lái)影響軟骨細(xì)胞和基質(zhì)改變的,從而提出抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路是一個(gè)治療OA潛在藥物作用靶點(diǎn)。臨床上OA的早期治療以基礎(chǔ)治療和藥物治療為主,雖然可以減輕疼痛、緩解部分癥狀,但尚不能延緩疾病的進(jìn)展,且口服藥物還存在不可忽視的副作用,如潛在的損害消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)等。雖然人工關(guān)節(jié)置換術(shù)作為一種可以真正阻斷OA進(jìn)展達(dá)到臨床治愈的措施,但由于人工關(guān)節(jié)材料磨損、價(jià)格昂貴以及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等并發(fā)癥的存在,其目前主要適用于癥狀嚴(yán)重的晚期OA患者。對(duì)于早、中期OA患者,仍然缺乏有效干預(yù)疾病進(jìn)展的方式。因此,深入研究骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制和治療方法有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義及價(jià)值。雷公藤紅素是一種從雷公藤根部提取的醌甲基三萜化合物,因抗癌和抗炎作用受到廣泛關(guān)注。以前的報(bào)告清楚地證實(shí)了雷公藤紅素能夠調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路、粘附分子、細(xì)胞因子和趨化因子,包括CXCR4。與雷公藤紅素在癌癥和炎癥中的有益作用一致,在實(shí)驗(yàn)室和臨床中都能觀察到雷公藤紅素對(duì)不同形式的關(guān)節(jié)炎具有強(qiáng)有力的療效。在之前的報(bào)道中,Yadav等人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素具有通過(guò)下調(diào)CXCR4的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的潛力。同樣,雷公藤紅素在缺氧條件下通過(guò)抑制CXCR4抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLSs)的遷移和侵襲,從而改善RA。其他報(bào)道也揭示了雷公藤紅素對(duì)MMPs和炎性細(xì)胞因子的抑制作用,這些都可能參與關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程。總之,這些結(jié)果為雷公藤紅素治療RA患者提供了機(jī)制上的依據(jù),然而,關(guān)于雷公藤紅素在OA病理過(guò)程中具體調(diào)節(jié)功能的數(shù)據(jù)有限。考慮到SDF-1/CXCR4在OA進(jìn)展中的關(guān)鍵作用,我們有理由推測(cè)雷公藤紅素作為一種影響SDF-1/CXCR4的中草藥產(chǎn)品,在OA治療中具有顯著的療效及無(wú)限的應(yīng)用潛力。因此我們有必要進(jìn)行了一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)探討雷公藤紅素在OA中的作用及機(jī)制。第一部分雷公藤紅素抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及分解代謝目的:觀察雷公藤紅素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的毒性作用;觀察雷公藤紅素拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及分解代謝作用。方法:取4周齡SD大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)傳至第3代,并用番紅O染色及Ⅱ型膠原熒光免疫熒光法進(jìn)行軟骨細(xì)胞的鑒定;雷公藤紅素處理大鼠軟骨細(xì)胞后,用細(xì)胞計(jì)數(shù)活性法(CCK-8)檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響;用雷公藤紅素干預(yù)IL-1β(10ng/ml)刺激的軟骨細(xì)胞,用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-13、ADAMTS-5基因的表達(dá)變化,并提取細(xì)胞蛋白,采用Western blot法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中MMP-13、ADAMTS-5表達(dá)變化,從蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證;收集軟骨細(xì)胞上清液,采用ELISA法檢測(cè)炎性因子COX-2及iNOS的濃度變化。用雷公藤紅素處理大鼠軟骨細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan基因的表達(dá)。結(jié)果:1.成功分離并培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞,經(jīng)番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定提取的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。2.通過(guò)CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn):雷公藤紅素在0.2μM-1.2μM濃度范圍內(nèi),對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用;其中0.8μM濃度的雷公藤紅素對(duì)軟骨細(xì)胞的活性較好。3.雷公藤紅素抑制MMP-13和ADAMTS-5表達(dá),同時(shí)抑制炎癥因子COX-2和iNOS表達(dá)。4.雷公藤紅素可以促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan的基因表達(dá)。結(jié)論:1.雷公藤紅素在0.2μM-1.2μM濃度范圍內(nèi),對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用;0.8μM濃度的雷公藤紅素對(duì)軟骨細(xì)胞的活性較好。2.雷公藤紅素對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有抗炎抗降解的作用;雷公藤紅素可以在一定程度上促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)作用。第二部分雷公藤紅素延緩大鼠骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展目的:以單碘乙酸鹽(MIA)誘導(dǎo)的大鼠OA模型為研究對(duì)象,觀察雷公藤紅素治療OA前后,大鼠關(guān)節(jié)疼痛和軟骨損傷的變化;探討雷公藤紅素在大鼠OA中對(duì)MMPs、COMP fragment、Ⅱ 型膠原蛋白、Aggrecan 的影響。方法:24只重約200-220g的SD大鼠隨機(jī)分為4組,Sham組、OA組、雷公藤紅素低劑量組、雷公藤紅素高劑量組,每組6只,我們采用MIA誘導(dǎo)OA大鼠模型;在造模后的第二天關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同劑量的雷公藤紅素,連續(xù)注射14天,在第0、7、14天通過(guò)行走距離、站立次數(shù)、后爪重量分布的變化來(lái)評(píng)估造模前后及治療前后大鼠骨關(guān)節(jié)炎疼痛的變化;并采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)疼痛基因CCR-2和MCP-1表達(dá)變化;在治療后第14天取股骨髁膝關(guān)節(jié)標(biāo)本,并用福爾馬林固定后進(jìn)行脫鈣、脫水及蠟塊制作,制片成功后使用番紅O染色并采用OOCHAS評(píng)分系統(tǒng)觀察關(guān)節(jié)軟骨的改變;對(duì)大鼠血清中的COMP fragment進(jìn)行Elisa檢測(cè),并在組織切片進(jìn)行了 COMP fragment的免疫組化染色,觀察雷公藤紅素是否可以抑制COMP降解;應(yīng)用免疫組化檢測(cè)MMP-13表達(dá)變化,并采用Western blot法檢測(cè)不同劑量的雷公藤紅素對(duì)MIA誘導(dǎo)的OA大鼠模型中MMP-3、MMP-9、MMP-13、Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan的表達(dá)情況;結(jié)果:1.大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA后,OA組較Sham組的行走距離、站立次數(shù)明顯減少,后爪重量分布顯著減少(P0.01);注射雷公藤紅素組與OA組相比,在第7天和14天觀察雷公藤紅素組的行走距離、站立次數(shù)明顯增多,后爪重量分布明顯升高(P0.01);疼痛基因CCR-2和MCP-1的表達(dá)雷公藤紅素治療組明顯低于OA組(P0.01),且具有劑量依賴(lài)性。2.軟骨組織番紅O染色:Sham組關(guān)節(jié)軟骨的番紅O染色無(wú)明顯減退,潮線(xiàn)完整;軟骨細(xì)胞數(shù)量及排列正常;蛋白多糖(PG)含量正常;OA組關(guān)節(jié)可見(jiàn)軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,局部細(xì)胞排列紊亂不規(guī)則,蛋白多糖(PG)含量明顯減少;雷公藤紅素注射組可見(jiàn)局部軟骨細(xì)胞明顯增多,排列較整齊,蛋白多糖(PG)含量明顯增加。OA組的OOCHAS評(píng)分明顯高于正常組,而雷公藤紅素組的OOCHAS評(píng)分明顯比OA組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.雷公藤紅素治療組大鼠關(guān)節(jié)炎模型中血清COMP fragment濃度低于OA組。4.組織切片進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果顯示雷公藤紅素治療組COMP fragment、MMP-13 均少于 OA 組。5.雷公藤紅素能明顯抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達(dá),且雷公藤紅素高劑量組(2mg/kg)較低劑量組(1mg/kg)抑制效果更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,與 OA 組相比)。6.雷公藤紅素能夠上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、Aggrecan的蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,與OA組相比),且有劑量依懶性。結(jié)論:雷公藤紅素能夠減輕大鼠OA疼痛癥狀及軟骨損傷,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達(dá),上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白、Aggrecan的蛋白表達(dá),減輕軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解,從而延緩大鼠OA進(jìn)展。第三部分:雷公藤紅素抗骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)機(jī)制的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)研究目的:探討雷公藤紅素對(duì)OA動(dòng)物模型和IL-1 β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞抗炎抗降解作用的分子機(jī)制。方法:我們體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以MIA誘導(dǎo)的大鼠OA為研究對(duì)象,采用Western blot方法檢測(cè)Sham組、OA組以及不同劑量雷公藤紅素組中SDF-1和CXCR4表達(dá)水平;體外實(shí)驗(yàn)為取4周齡SD大鼠股骨頭關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)傳至第3代,加入不同濃度的雷公藤紅素干預(yù),用IL-1β(1Ong/ml)刺激的軟骨細(xì)胞,用PCR法檢測(cè)不同濃度雷公藤紅素干預(yù)后軟骨細(xì)胞中CXCR4表達(dá)水平變化;通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染使軟骨細(xì)胞中CXCR4過(guò)表達(dá),用PCR法檢測(cè)ECM降解酶MMP-13和ADAMTS-5的信使RNA水平的變化。結(jié)果:1.雷公藤紅素抑制OA大鼠模型軟骨組織中SDF-1和CXCR4的表達(dá),且雷公藤紅素高劑量組較低劑量組抑制作用更明顯;2.雷公藤紅素抑制IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞中CXCR4的基因表達(dá),其濃度越高,雷公藤紅素抑制CXCR4作用越明顯。3.通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染使軟骨細(xì)胞過(guò)表達(dá)CXCR4基因,結(jié)果顯示:1)在CXCR4正常表達(dá)的前提下,經(jīng)雷公藤紅素干預(yù)后,軟骨細(xì)胞中MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)較未干預(yù)組明顯降低;2)在同等劑量雷公藤紅素干預(yù)的前提下,在過(guò)表達(dá)CXCR4基因組中雷公藤紅抑制MMP-13和ADAMTS-5基因的能力較CXCR4基因正常表達(dá)組明顯減弱;3)在不經(jīng)雷公藤紅素干預(yù)的前提下,過(guò)表達(dá)CXCR4基因組中,MMP-13和ADAMTS-5表達(dá)較CXCR4基因正常表達(dá)組明顯升高。結(jié)論:1.雷公藤紅素能夠抑制大鼠OA模型中SDF-1和CXCR4的表達(dá),且存在劑量依賴(lài)性;2.雷公藤紅素能夠抑制IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中CXCR4的表達(dá),且存在濃度依賴(lài)性;3.雷公藤紅素可通過(guò)抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路來(lái)降低MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

２）．番紅Ｏ染色鑒定軟骨細(xì)胞逡逑番紅０是堿性染料可與核酸結(jié)合顯示紅色，染色后我們可以看到細(xì)胞核粉紅色（見(jiàn)圖３）。逡逑圖３：軟骨細(xì)胞番紅０染色（ｘ２００）逡逑３）邋．１１型膠原免疫熒光法鑒定逡逑ＩＩ型膠原是軟骨細(xì)胞分泌的特異性膠原，可利用ＩＩ型膠原的免疫熒光對(duì)軟逡逑骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。熒光標(biāo)記后，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)ＩＩ型膠原表達(dá)陽(yáng)性，呈紅褐色熒逡逑光，細(xì)胞核不著色，為藍(lán)色熒光，激光共聚焦顯微鏡下軟骨細(xì)胞形態(tài)清晰可見(jiàn)。逡逑３３逡逑

圖２：原代軟骨細(xì)胞（ｘ４０）逡逑２）．番紅Ｏ染色鑒定軟骨細(xì)胞逡逑

圖６：為圖４和圖５的重疊，胞質(zhì)為紅褐色熒光，胞核為藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)清晰２．雷么Ｖ藤紅素對(duì)軟骨細(xì)胞活性無(wú)影響逡逑我們采用經(jīng)典的ＣＣＫ８法，探索不同濃度的雷公藤紅素對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞的影響，參考既往的研究文獻(xiàn)，我們選取的濃度范圍為0．２ｈＭ邋－１．２ｎＭ。實(shí)驗(yàn)結(jié)逡逑果表明在０．２＾Ｍ邋－１．２ＭＭ濃度范圍內(nèi)的雷公藤紅素對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞無(wú)明顯毒性及逡逑抑制作用，各濃度孔與對(duì)照孔相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＞ａ0５）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)０．８ｆｉＭ逡逑濃度的雷公藤紅素對(duì)軟骨細(xì)胞的活性較好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇了邋０．８ｐＭ組逡逑（見(jiàn)圖７）。逡逑３４逡逑

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本文編號(hào)：2752979