發(fā)布時(shí)間：2020-07-12 19:56

【摘要】：目的:初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法、多肽含量測定方法,深入研究美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤作用及體外對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響,旨在為美洲大蠊用于惡性腫瘤的治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)可為從天然藥物中提取低毒高效的抗腫瘤活性部位提供新方向。方法:(1)制備工藝研究:采用超聲法、滲濾法、加熱回流法三種方法提取美洲大蠊多肽,同時(shí)采用福林酚法和雙縮脲法兩種方法測定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量,比較三種提取方法和兩種測定方法的結(jié)果從而初步優(yōu)選美洲大蠊多肽提取物的提取方法及多肽測定方法,。(2)體內(nèi)抗腫瘤活性評價(jià):建立小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180的移植性腫瘤模型,檢測美洲大蠊多肽提取物對腫瘤生長的影響。觀察小鼠的活動(dòng)情況及體重變化,評價(jià)美洲大蠊多肽提取物的體內(nèi)抗腫瘤活性。(3)體外對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響:以A549(人肺腺癌細(xì)胞株)、SGC-7901(人胃癌細(xì)胞株)和Hela(人宮頸癌細(xì)胞株)為實(shí)驗(yàn)對象,經(jīng)不同濃度的美洲大蠊多肽提取物作用48 h后,采用Cell Counting Kit(CCK-8)WST-8試劑盒測定對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。美洲大蠊多肽提取物對A549細(xì)胞凋亡的影響采用Hoechst 33258熒光染色及流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法進(jìn)行檢測。結(jié)果:(1)加熱回流法提取的美洲大蠊多肽含量為34.18%和30.05%,超聲法為25.63%和20.19%,滲濾法為28.74%和24.90%,加熱回流法對美洲大蠊多肽的提取明顯優(yōu)于超聲法和滲濾法。雙縮脲法測定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量為25.63%、28.74%、34.18%,福林酚法為20.19%、24.90%、30.05%,通過兩種方法的比較,雙縮脲法對多肽測定存在高效性,明顯優(yōu)于福林酚法。(2)美洲大蠊多肽提取物25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg(以多肽濃度計(jì)算)對H22實(shí)體瘤生長的抑瘤率分別為23.77%、35.83%、65.63%;對S180實(shí)體瘤生長的抑瘤率分別為20.16%、35.27%、57.36%,明顯抑制S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。(3)美洲大蠊多肽提取物能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖,隨濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),其IC50為54.65±1.73μg/ml,但對SCG-7901、Hela細(xì)胞作用不強(qiáng),因此僅采用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。美洲大蠊多肽提取物作用于A549細(xì)胞48h后,Hoechst 33258熒光染色顯示,不同濃度的美洲大蠊多肽提取物干預(yù)后可見核濃縮致密的強(qiáng)熒光團(tuán)塊及核碎裂等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,而陰性對照組成彌散均勻的淡藍(lán)色弱熒光。AnnexinV/PI雙染法檢測顯示,10、20、40、80、160μg/ml(以多肽濃度計(jì)算)的美洲大蠊多肽提取物均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,凋亡率分別為20.43±1.53%,34.86±2.01%,44.68±1.84%,53.19±1.53和65.57±2.14%,與陰性對照組比較,差異有顯著性(P0.01)。結(jié)論:美洲大蠊多肽提取物最佳的提取方法是加熱回流法,多肽含量測定以雙縮脲法最優(yōu);美洲大蠊多肽提取物能明顯抑制S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長,具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性;美洲大蠊多肽提取物能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,抑制其增殖。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

圖 2 福林酚法測得牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線ig.2 The standard curve of the reference substance of BSAof Lowry method 雙縮脲法脲試液配制：

圖 3 雙縮脲法測得牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of the reference substance of BSAof Biuret method3 比較美洲大蠊多肽提取物中多肽含量的兩種測定方法將用超聲法、加熱回流法、滲濾法三種方法提取的的美洲大蠊

1. 丙氨酸 2. 甘氨酸 3-5. 美洲大蠊多肽提取物圖4 美洲大蠊多肽提取物薄層色譜鑒別Fig 4 The TLC identification of polypeptide extract of Periplaneta americana實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在美洲大蠊多肽提取物色譜中，美洲大蠊多肽提取物色譜中與對照品有相同的顯色點(diǎn)，說明美洲大蠊多肽提取物是由甘氨酸、丙氨酸等多種氨基酸組合的混合型多肽。3.4.2 對美洲大蠊多肽提取物中多肽分子量的測定3.4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法采用 SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠）電泳法。配制好 12.5%的分離膠， 10%的夾層膠， 4%的濃縮膠。制板厚度1.00mm。將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，兩玻璃板間加入陰極電泳緩沖液，電泳槽內(nèi)加入陽極電泳緩沖液。待濃縮膠聚合后拔出樣品梳，點(diǎn)樣，依次加入對照品和供試品。接通電泳儀電源后，開始電壓 60-80V

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本文編號：2752420