發(fā)布時間：2020-07-12 19:15

【摘要】：目的:肝癌是世界范圍內癌癥相關死亡的第三大原因,其發(fā)病率和死亡率逐年上升,已有的化療藥物毒性較大且治療效果不佳,亟待開發(fā)安全高效的新型治療藥物。淫羊藿素是由中藥淫羊藿中提取的黃酮類單體化合物淫羊藿苷水解而成,對肝癌具有較好的治療效果,目前已進入臨床三期研究。但其水溶性差,生物利用度低,有效劑量大,一定程度上限制了其臨床應用。本研究將淫羊藿素與葡萄糖偶聯(lián),以期增加其溶解度及腫瘤靶向性,對化合物理化性質、制劑進行研究,并考察了化合物體外抗肝癌活性和作用機制。方法:1.淫羊藿素衍生物的制備及表征通過多步化學反應制備葡萄糖衍生物(編號a,b,c),直鏈二醇及其衍生物的酸酐(編號1-9),通過酯化反應以酸酐取代淫羊藿素上的羥基,再與葡萄糖衍生物進行點擊反應,得到目標化合物。并用核磁共振譜對化合物結構進行表征。2.淫羊藿素衍生物純度及溶解度考察建立了一種純度測定的高效液相方法,并進行了方法學驗證;考察衍生物的穩(wěn)定性及不同批次制備樣品的重復性。以HPLC考察合成得到的產物在水、PBS、生理鹽水、0.1%吐溫80中的溶解度,同時考察了yyhs-1-b、yyhs-2-a在玉米油、無水乙醇、丙二醇、HS15中的溶解度。3.淫羊藿素衍生物體外抗肝癌活性及機制研究選擇人源肝癌細胞Hep G2和SMMC7721作為細胞模型考察合成得到的淫羊藿素衍生物在肝癌細胞上的毒性;選擇肝癌細胞Hep G2進行進一步的體外抗肝癌活性研究;選擇正常肝細胞LO2進行安全性考察。實驗分為:空白對照組、淫羊藿素組、淫羊藿素衍生物組。以MTT法檢測細胞活性(給藥濃度最大為100μM);通過細胞劃痕實驗及Transwell實驗考察不同給藥組處理細胞后的侵襲和遷移率(給藥濃度為:6.25,12.50,25μM);通過Hochest 33258細胞核染色法和Annexin V/PI流式細胞術考察給藥后細胞凋亡情況及細胞(給藥濃度為:6.25,12.50,25μM);以MTT法及平板克隆實驗考察細胞增殖(給藥濃度為:1.25,2.5,5,10μM);以蛋白印跡法檢測Hep G2細胞蛋白表達(給藥濃度為:12.50μM)。4.淫羊藿素衍生物體內抗肝癌活性初步考察選擇人源肝癌細胞Hep G2作為細胞模型,以雄性Balb/c裸鼠建立肝癌皮下瘤模型,以生理鹽水、淫羊藿素、yyhs-1-b、yyhs-2-a進行腹腔給藥治療,給藥濃度為:淫羊藿素(Icaritin)10 mg/kg,yyhs-1-b高劑量25.30mg/kg,低劑量12.65mg/kg,yyhs-2-a高劑量22.91mg/kg,低劑量11.45mg/kg,共給藥21天,每3天測量裸鼠體重及腫瘤體積并繪制生長曲線。5.淫羊藿素脂質體的制備及表征采用薄膜水化-旋轉蒸發(fā)法制備脂質體,分別將淫羊藿素及合成得到的yyhs-1-b及yyhs-2-a包載進脂質體中,通過馬爾文激光粒度儀,測定脂質體的粒徑及電位;以HPLC檢測脂質體包封率。結果:1.淫羊藿素衍生物的制備及表征成功制備得到了目標化合物yyhs-1-a、yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-2-b、yyhs-3-a、yyhs-3-b、yyhs-4-a、yyhs-4-b、yyhs-4-c、yyhs-5-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-5-c、yyhs-6-a、yyhs-7-a、yyhs-7-b、yyhs-7-c、yyhs-8-a、yyhs-8-b、yyhs-8-c、yyhs-9-a、yyhs-9-b、yyhs-9-c。2.淫羊藿素衍生物純度及溶解度考察通過HPLC對合成的產物純度進行檢測,純度均大于97%;純度檢測方法學驗證得到,RSD值均小于2%,表明:檢測方法專屬性強,準確度高,重復性良好;淫羊藿素衍生物能夠在溶劑中穩(wěn)定保存12 h,在4℃條件下穩(wěn)定保存84天,檢測結果顯示RSD值均小于2%。溶解度測定結果得到,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-8-b、yyhs-9-c的溶解度相較于淫羊藿素明顯提高;在玉米油、無水乙醇、丙二醇、HS15中yyhs-1-b、yyhs-2-a的溶解對均大于淫羊藿素2倍左右,表明對淫羊藿素進行結構修飾能夠改淫羊藿素的溶解度。3.淫羊藿素衍生物體外抗肝癌活性研究MTT實驗結果顯示,淫羊藿素的IC50為20.59±2.82μM,在48 h時,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-8-b、yyhs-9-c的IC50分別為:14.86±0.22,10.31±1.19,11.99±0.82,15.05±1.32μM,與淫羊藿素相比,能夠明顯抑制Hep G2細胞活性;在72 h時yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-b、yyhs-5-c、yyhs-6-a、yyhs-7-a、yyhs-8-b、yyhs-9-c的IC50分別為:7.09±0.38,7.91±0.98,5.56±0.60,10.11±0.32,11.99±1.23,7.03±0.67,5.56±0.60,7.69±0.04μM,而淫羊藿素為16.05±1.27μM,對Hep G2細胞活性具有明顯的增強抑制效果;在48 h時yyhs-1-b、yyhs-2-a(IC50分別為:9.30±0.35,10.31±1.19μM)與淫羊藿素(IC50為23.24±1.02μM)相比,能夠明顯抑制SMMC7721細胞活性;在72 h時yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-2-b、yyhs-5-b、yyhs-7-a、yyhs-8-a、yyhs-8-b、yyhs-8-c、yyhs-9-b、yyhs-9-c(IC50分別為:5.99±0.49,5.823±1.04,2.51±0.72,6.65±1.29,12.68±1.02,5.644±0.65,6.65±1.29,8.68±0.52,12.9±1.03,9.57±1.20μM)與淫羊藿素(IC50為14.96±0.66μM)相比能夠明顯抑制SMMC7721細胞活性。細胞劃痕實驗及Transwell試驗結果表明,與淫羊藿素組相比yyhs-1-b、yyhs-2-a可顯著抑制細胞的侵襲和遷移。Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率,結果顯示,yyhs-1-b、yyhs-2-a導致Hep G2凋亡,在25μM時淫羊藿素、yyhs-1-b及yyhs-2-a的凋亡率分別為:47.47±2.85%,23.86±1.26%,21.45±0.47%,在給藥12.5μM時的凋亡率分別為41.70±1.91%,18.74±0.40%,17.92±1.16%;在給藥6.25μM時的凋亡率分別為:13.45±1.23%,13.67±0.72%,12.30±0.46%;Hoechst 33258染色結果表明,給藥處理24 h后,yyhs-1-b、yyhs-2-a組細胞嚴重受損,細胞凋亡最多。MTT實驗表明與淫羊藿素相比yyhs-1-b、yyhs-2-a能夠顯著抑制細胞增殖,平板克隆實驗顯示,在給藥濃度為10μM時,細胞幾乎不增殖,在給藥濃度為5μg/m L時,yyhs-1-b的克隆形成率僅為:13.4±1.11%,yyhs-2-a的克隆形成率為:9.33±1.50%。蛋白表達檢測發(fā)現(xiàn),yyhs-1-b、yyhs-2-a能夠有效促進Hep G2細胞中蛋白Bax、caspase-3的表達,減弱Bcl-2的表達,增強凋亡效果。安全性實驗發(fā)現(xiàn),與淫羊藿素組相比,yyhs-1-b、yyhs-2-a、yyhs-5-b、yyhs-8-b、yyhs-9-c具有較高的安全性,在最大給藥濃度100μM時正常細胞LO2細胞存活率均大于60%。4.淫羊藿素衍生物體內抗肝癌活性初步考察通過對治療結束后裸鼠體積進行測量結果顯示,給藥生理鹽水組腫瘤體積為857±132.5 mm3,淫羊藿素組腫瘤體積為:404.05±112.94 mm3;yyhs-1-b低劑量組、yyhs-1-b高劑量組、yyhs-2-a低劑量組、yyhs-2-a高劑量組腫瘤體積分別為:221.88±118.02、38.87±16.57、204.92±48.36、81.84±67.34mm3,與淫羊藿素組相比能夠明顯抑制腫瘤的增長,尤其是yyhs-1-b高劑量組和yyhs-2-a高劑量組具有較高的治療效果,體內抗肝癌活性高。5.淫羊藿素及其衍生物脂質體的制備及表征成功制備得到淫羊藿素、yyhs-1-b、yyhs-2-a及空白脂質體,載藥脂質體粒徑分別為:71.30±0.15,98.80±2.20,90.40±0.74 nm;電位分別為:0.12±0.11,1.74±0.57,1.22±0.62。包封率分別為97.41±1.60%,95.29±1.40%,90.40±1.42%�？瞻字|體的粒徑電位分別為:60.40±0.94nm,-11±0.53。結論:綜上所述,本研究成功合成了一系列淫羊藿素衍生物,并對化合物理化性質進行考察。合成方法簡單重復性高,得到的產物純度高,純度檢測方法具有較高的專屬性、準確度及精密度。通過引入葡萄糖基團,有效提高的淫羊藿素的溶解度,提高了其生物利用度,明顯提高了淫羊藿素的抗肝癌活性。本課題的研究為肝癌的治療提供了新的研究方向,具有重大的研究價值。
【學位授予單位】：西南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

丁二酸酐（成都市科龍化工試劑廠）；4-二甲氨基吡啶（DMAP）(成都市科龍化工試劑廠)；1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）（韶遠化學科技（上海）有限公司）；氘代二甲基亞砜（DMSO-d6），氘代甲醇（CD3OD）（Cambridge IsocopeLaboratories,Inc.Lot#：PR-26893/09285DM1）；二碳酸叔丁酯（Diboc）；（成都吉安特醫(yī)藥科技有限公司）；氫化鈉、3-溴丙炔、無水硫酸鈉、無水硫酸銅、抗壞血酸鈉、碳酸氫鈉、DMF其余試劑均為分析純。2.2 試驗方法與結果2.2.1.淫羊藿素結構修飾產物的合成及表征2.2.1.1.yyhs-1-a 的合成及表征合成路線（圖 2-1）：

圖 2-2 yyhs-1-a 核磁示意圖Figure 2-2. Schematic diagram of yyhs-1-a nuclear magnetic field2.2.1.2.yyhs-1-b 的合成及表征合成路線（圖 2-3）：OOOOHOHOOOOyyhs-1-bOOOOHOHOOOOOOOO10-2NNNOOOOOHOHOOHOOHb THF-H2OCuSO4OOAcOOAcAcOAcOBrOOAcOOAcAcOAcON3OAcOOAcAcOAcOOAcOOHOOHHOHON3b-1 b-2bC2H5BrO NaN3NaOMe-MeOH圖 2-3 yyhs-1-b 的合成示意圖Figure 2-3. yyhs-1-b synthesis diagram稱量 18 g 化合物 1,2,3,4,6-β-D 葡萄糖五乙酸酯溶于 150 mL 二氯甲烷，置于500 mL 茄形瓶中，加入 6.3 g 溴乙醇和 8.7 mL 三氟化硼乙醚，室溫下攪拌反應

室溫攪拌過夜，加入適量的強酸性陽離子交換樹脂，繼續(xù)攪拌 15 min，測量體系中pH為中性或弱酸性，過濾，濾液濃縮后得到820 mg 化合物b（圖2-3）。將 70 mg 化合物 10-2 和 26 mg 化合物 b 溶于 10 mL 1:1 的 THF-H2O 混合溶劑中，依次加入 26 mg 無水硫酸銅和 32 mg 抗壞血酸鈉，室溫攪拌過夜，濃縮后快速柱分離（DCM:MeOH=8:1）得到粗品，制備板分離（DCM:MeOH=8:1）得到 38.3 mg 淺黃色固體化合物 yyhs-1-b（圖 2-3），收率 37.7%。取適量終產物溶于氘代甲醇（CD3OD）中，送核磁檢測（圖 2-4），分析產物各特征氫質子的化學位移 δ (ppm)，歸屬如下：1H NMR (400 Hz, CD3OD) δ 8.07 (s, 1H), 7.92 (d, J =9.2 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.18 (s, 1H), 4.60-4.63 (m, 4H), 4.28 (d, J = 8.0Hz, 1H), 4.20-4.22 (m, 3H), 3.96-4.01 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.84 (d, J = 11.6 Hz, 1H)3.65-3.67 (m, 3H), 3.58-3.62 (m, 11H), 3.32-3.35 (m, 1H), 3.24-3.26 (m, 2H), 3.16 (t,J = 8.4 Hz, 1H), 2.99 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.73-2.76 (m, 2H),1.91 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.38 (s, 6H)。

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