【摘要】：目的:1.評(píng)估丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)預(yù)處理抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用和量效關(guān)系;2.評(píng)估Sal B預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的影響;3.探討Sal B在大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌保護(hù)中對(duì)心肌SIRT1表達(dá),及由SIRT1介導(dǎo)的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;4.在心肌細(xì)胞糖氧剝奪再灌(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGDR)模型下,探討Sal B心肌保護(hù)作用與SIRT1蛋白表達(dá)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡間的關(guān)系。方法:A.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:本研究采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型,SD大鼠隨機(jī)入組,組別分別為:SHAM組,缺血再灌注模型(Ischemia/Reperfusion,I/R)組,Sal B LD 組(LD:30mg/kg),SalB HD 組(HD:60mg/kg),SalB HD+EX527 組(EX527:2mg/kg);每組 N=16。給藥4天后,除SHAM組行假手術(shù)外,其余各組均結(jié)扎冠脈左前降支(left anterior descdending coronary,LAD)0.5h,復(fù)灌24h,后進(jìn)行下一步驟:1.所有大鼠行心臟超聲,檢測(cè)大鼠心功能;2.后腹主動(dòng)脈取血,離心后取上清-20℃凍存,以備Elisa用;3.取心臟組織,隨機(jī)從各組中取3只大鼠心臟多聚甲醛固定,制作石蠟切片,以備 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)/IHC(immunohistochemistry)用;另各組中隨機(jī)取3只大鼠行TTC染色;剩余大鼠心臟取出后剪取梗死邊緣區(qū)2mm心臟組織提取蛋白,以備western blot用;具體觀察指標(biāo)如下:1.心臟功能和大小:心臟超聲①左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、每搏輸出量(stroke volume,SV)左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)等;2.心肌損傷標(biāo)志物及炎癥指標(biāo):Elisa法測(cè)LDH/CK-MB/TNF-α/IL-1β/IL-18/HMGB1;3.心臟梗死面積檢測(cè):TTC染色;4.心肌梗死缺血再灌注心臟組織凋亡觀察:TUNEL染色;5.組織蛋白免疫組化檢測(cè):SIRT1/ac-HMGBl/TLR4;6.心肌梗死缺血再灌注損傷信號(hào)通路作用靶點(diǎn)檢測(cè):western blot:SIRT1、ac-HMGB1、c-HMGB1、N-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bcl-2、Bax;B.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:采用H9C2細(xì)胞,探索建立細(xì)胞OGDR細(xì)胞模型條件、SIRT1抑制劑EX527最小有效濃度以及SalB細(xì)胞毒性測(cè)定,確定SalB干預(yù)濃度;分組如下:Control組,Sal B組,Model 組,Sal B LD 組,Sal B HD 組,SalB HD+EX527 組;實(shí)驗(yàn)步驟如下:第一階段,將密度為2*104個(gè)/ml的心肌細(xì)胞均勻種于96孔板中孵育24h。OGDR組分別用無(wú)糖培養(yǎng)基在低氧(1%O2)環(huán)境下培養(yǎng),后更換正常培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng),探索OGDR模型建立條件;6孔板孵育H9C2,control組不做任何處理,EX527組分別用50 μM,25μM,12.5 μM三個(gè)濃度,westernblot測(cè)定SIRT1表達(dá)水平,確定EX527最小有效濃度;SalB組毒性試驗(yàn):MTT法,分別用200 μM,100μ M,50μ M,0μ M測(cè)定Sal B最高安全濃度;第二階段,分別對(duì) control 組,SalB 組,Model 組,Sal B LD 組,Sal B HD 組,SalB HD+EX527組予藥物處理,培養(yǎng)24h后,建立OGDR模型,之后檢測(cè)下列指標(biāo):1.MTT檢測(cè):在OGDR模型下,不同濃度SalB預(yù)處理后H9C2細(xì)胞的活性;2.細(xì)胞損傷標(biāo)志物及炎癥指標(biāo)檢測(cè):Elisa法檢測(cè)培養(yǎng)基LDH/CK-MB/TNF-α/HMGB1;3.細(xì)胞內(nèi)損傷信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè):western blot檢測(cè)SIRT1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B;Bcl-2,Bax。結(jié)果:A.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):1.心臟功能評(píng)價(jià):I/R 組大鼠 EF、FS、SV 低于正常組(P0.05);Sal B LD 組、Sal B HD 組 EF 與I/R 組比較,EF 均高于 I/R 組(P0.05);Sal B HD 組 EF 高于 Sal B LD 組(P0.05);Sal B HD+EX527 組 EF、FS、SV 低于 Sal B HD 組(P0.05)。I/R 組心率高于正常組,Sal B LD 組、Sal B HD 組、Sal B HD+EX527 組與 I/R 無(wú)差異(P0.05)。2.心肌損傷標(biāo)志物評(píng)價(jià)I/R組大鼠心肌LDH、CK-MB水平高于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,LDH、CK-MB水平均低于I/R組(P0.05);Sal B HD組LDH、CK-MB水平低于 Sal B LD 組P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組 LDH、CK-MB水平上升(P0.05)。3.解剖學(xué)評(píng)價(jià):I/R組大鼠心肌梗死面積顯著高于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,梗死面積占左室面積的百分比均低于I/R組(P0.05);Sal B HD組心肌梗死面積低于Sal B LD組(P0.05);與Sal B HD組相比,Sal B HD+EX527組梗死面積升高(P0.05);4.病理學(xué)評(píng)價(jià):Tunel染色:I/R組大鼠細(xì)胞凋亡率高于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,細(xì)胞凋亡率均低于I/R組(P0.05);Sal B HD組細(xì)胞凋亡率低于Sal B LD 組(P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組率升高(P0.05)。5.組織蛋白表達(dá)評(píng)價(jià):Western blot:I/R 組大鼠心肌 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表達(dá)低于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,心肌SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1表達(dá)均高于I/R 組(P0.05);Sal B HD 組 SIRT1 Bcl-2、N-HMGB1 表達(dá)高于 Sal B LD 組(P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表達(dá)降低(P0.05)。與之相反的是,I/R組SD大鼠心肌C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B表達(dá)高于正常組(K0.05);Sal B LD 組、Sal B HD 組與 I/R 組比較,C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B 表達(dá)均低于 I/R 組(P0.05);Sal B HD 組 C-HMGB1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 表達(dá)低于 Sal B LD 組(K0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527組C-HMGB1、ac-HMGBl、TLR4、NF-κ B、Bax 表達(dá)升高(P0.05)。免疫組化:I/R組大鼠心肌SIRT1表達(dá)低于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,SIRT1均高于I/R組(P0.05);Sal B HD組SIRT1表達(dá)高于Sal B LD 組(P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組 SIRT1 降低(P0.05)。與之相反的是,I/R組SD大鼠ac-HMGB1、TLR4表達(dá)高于正常組(P0.05);Sal B LD組、Sal B HD組與I/R組比較,ac-HMGB1、TLR4表達(dá)均低于I/R組(P0.05);Sal B HD組ac-HMGB1、TLR4表達(dá)低于Sal B LD組,有顯著性差異(P0.05);與Sal B HD組相比,Sal B HD+EX527 組 ac-HMGB1、TLR4 表達(dá)升高(P0.05)。6.炎癥相關(guān)因子評(píng)價(jià)I/R 組大鼠 TNF-α、HMGB1 水平高于正常組(P0.05);Sal B LD 組、Sal B HD組與I/R組比較TNF-α、HMGB1水平均低于I/R組(P0.05);Sal B HD組TNF-α、HMGB1 水平低于 Sal B LD 組(P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組 LDH、CK-MB水平顯上升(P0.05)。B.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):1.OGDR細(xì)胞模型的建立:在缺氧24h,復(fù)氧2h時(shí)細(xì)胞活率到達(dá)63.8%,復(fù)氧4h細(xì)胞活性上升至80.1%。據(jù)此,確定OGDR模型建立時(shí)間為:缺氧24h,復(fù)氧2h。2.Sal B對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的毒性評(píng)估:結(jié)果顯示100 μ M、200 μ M細(xì)胞活性下降至76.7%和47.1%;50μM則與0μM無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。因此,確定Sal B最高給藥濃度為50 μM(設(shè)為細(xì)胞模型中:Sal B HD組),另設(shè)置25 μM為低劑量組(Sal B LD組);3.在OGDR模型下,Sal B預(yù)處理對(duì)細(xì)胞活性的評(píng)價(jià):在OGDR條件下,Sal B 25μ M、50μM分別提高細(xì)胞活性至75.2%和86.6%,且Sal B 25 μM與Sal B 50 μM間細(xì)胞活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),改善細(xì)胞活性呈濃度依賴性;EX527逆轉(zhuǎn)了 Sal B的這種作用。4.蛋白表達(dá)評(píng)價(jià):Model 組 SIRT1 表達(dá)低于 control 組(P0.05);與 Model 組比較,Sal B LD 組、Sal B HD 組 SIRT1、Bcl-2 表達(dá)均升高(P0.05),而 ac-HMGB1、TLR4、NF-κB、Bax表達(dá)下降(P0.05);Sal B HD組SIRT1、Bcl-2表達(dá)高于Sal B LD組(P0.05),ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax低于Sal BLD組(P0.05);與Sal B HD組相比,Sal B HD+EX527組 SIRT1、Bcl-2 表達(dá)降低(P0.05),同時(shí) ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 增高(P0.05)。5.炎癥相關(guān)因子評(píng)價(jià)I/R 組 TNF-α、HMGB1 水平高于正常組(P0.05);Sal B LD 組、Sal B HD 組與I/R 組比較 TNF-α、HMGB1 水平均低于 I/R 組(P0.05);Sal B HD 組 TNF-α、HMGB1水平低于 Sal B LD 組(P0.05);與 Sal B HD 組相比,Sal B HD+EX527 組 TNF-α、HMGB1水平上升(P0.05)。結(jié)論:1.Sal B能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷,呈劑量依賴性;2.Sal B減輕心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制可能是通過上調(diào)心肌SIRT1的表達(dá)從而抑制了 HMGB1的核移位與分泌,通過SIRT1介導(dǎo)的HMGB1/TLR4/NF-κ B信號(hào)通路,與改善大鼠心肌炎癥水平、細(xì)胞凋亡有關(guān);3.Sal B減輕了心肌細(xì)胞的炎癥水平,起到了“涼血消癰”的作用,我們因此推斷“熱毒”可能是心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)癥候本質(zhì)之一;SIRT1可能是丹參涼血消癰作用的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
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本文編號(hào)：
2751462
