【摘要】：研究背景:肥胖是一種多因素引起的慢性疾病,近年來(lái)隨著人們生活水平的提高和營(yíng)養(yǎng)條件的改善,肥胖成為全球范圍、尤其是以工業(yè)化國(guó)家為主所關(guān)注的公共健康問(wèn)題。肥胖被定義為由于脂肪細(xì)胞的增生和肥大,從而導(dǎo)致脂肪過(guò)量和脂肪組織過(guò)度堆積的一種狀態(tài)。脂肪組織不止是儲(chǔ)存脂肪的器官,也是調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝的重要場(chǎng)所,可以分泌瘦素(Leptin)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等因子,這些因子與許多生理和病理過(guò)程有關(guān)。肥胖者體內(nèi)伴隨著慢性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),這些進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷、功能失調(diào)和胰島素敏感性下降,導(dǎo)致一系列病理反應(yīng)。因此,針對(duì)脂肪組織氧化應(yīng)激和炎癥及其分子機(jī)制的研究為肥胖及相關(guān)疾病的防治提供新的作用靶點(diǎn)。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶中最豐富且最具有活性的成分,EGCG對(duì)肥胖的防治作用已被大量研究所證實(shí)。同時(shí)也有越來(lái)越多的研究表明,EGCG具有很強(qiáng)的抗炎抗氧化作用。但是EGCG是否能直接作用于脂肪細(xì)胞并具有抑制脂肪細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激的潛力以及相關(guān)作用機(jī)制,目前鮮有研究報(bào)道。本研究擬以3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察EGCG對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥水平的影響,并初步探索EGCG對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞Nrf2/HO-1的作用,為以氧化應(yīng)激和炎癥為靶標(biāo)治療肥胖及相關(guān)慢性病提供理論依據(jù)。目的:1.了解EGCG對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后3T3-L1脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和炎癥水平的影響;2.以Nrf2為靶點(diǎn),初步探索EGCG調(diào)控脂肪組織氧化應(yīng)激和炎癥的分子機(jī)制。方法:采用3T3-L1前體脂肪細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后模擬如下兩種狀態(tài),并采用不同ECGC予以干預(yù):1)3T3-L1脂肪細(xì)胞不作特殊處理的基礎(chǔ)狀態(tài):用(0μg/ml(空白組))、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml EGCG干預(yù)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞24h;2)采用LPS誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥狀態(tài):用(0μg/ml(LPS對(duì)照組))、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml EGCG預(yù)處理2h后,加1μg/mL LPS干預(yù)24h。檢測(cè)如下指標(biāo):1.氧化應(yīng)激水平的檢測(cè):采用TBA法、羥胺法和分光光度法分別檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)上述兩種狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量;2.炎癥水平的檢測(cè):1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)和LPS誘導(dǎo)后3T3-L1脂肪細(xì)胞上清液中相關(guān)炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、單核細(xì)胞趨化蛋-1(MCP-1)含量;2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)上述兩種狀態(tài)下的的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6、TNF-a、MCP-1mRNA表達(dá)量;3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度的EGCG對(duì)上述兩種狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)mRNA表達(dá)量。結(jié)果:1.無(wú)論基礎(chǔ)狀態(tài)或LPS誘導(dǎo)的狀態(tài)下,1μg/ml~50μg/ml EGCG干預(yù)均顯著降低成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞的MDA含量(P0.05),顯著提高SOD和GSH活性(P0.05),且均呈劑量依賴關(guān)系,其中50μg/ml EGCG作用對(duì)上述三個(gè)氧化應(yīng)激指標(biāo)最顯著,基礎(chǔ)狀態(tài)下50μg/ml作用濃度與空白組比較結(jié)果如下:MDA0.84±0.37 vs 3.01±0.99;SOD 143.17±14.18 vs 68.69±5.32;GSH 308.12±85.16vs 148.87±14.65;LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下50μg/ml作用濃度與LPS對(duì)照組比較結(jié)果如下:MDA 1.30±0.05 vs 9.81±0.10,SOD 188.35±13.87 vs 46.12±3.44;GSH366.60±60.40 vs 121.20±0.31。2.無(wú)論是基礎(chǔ)狀態(tài)或LPS誘導(dǎo)的狀態(tài)下,1μg/ml~50μg/ml EGCG干預(yù)均對(duì)成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞的炎癥因子IL-6、TNF-a、MCP-1的mRNA表達(dá)量和分泌量均有顯著的降低作用(P0.05),且均呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系,其中50μg/ml EGCG干預(yù)效果最為明顯:基礎(chǔ)狀態(tài)下50μg/ml作用濃度與空白組比較結(jié)果如下:IL-6 272.59±6.61 vs 216.73±22.81,MCP-1 1021.68±150.09 vs 2134.83±210.42,TNF-a 4.01±1.03 vs 10.33±1.18;LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下50μg/ml作用濃度與LPS對(duì)照組比較結(jié)果如下:IL-6 107.94±26.22 vs 272.59±6.61,MCP-1 1009.93±37.34 vs 2299.46±93.99,TNF-a 5.53±2.07 vs 18.51±0.49。3.無(wú)論是基礎(chǔ)狀態(tài)或LPS誘導(dǎo)的狀態(tài)下,10μg/ml~50μg/ml EGCG干預(yù)均顯著提高成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞的Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)量(P0.05)。且均呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。且50μg/ml EGCG干預(yù)效果最為明顯。結(jié)論:EGCG具有抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥水平作用,EGCG抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥的作用可能與上調(diào)Nrf2/HO-1有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

是公認(rèn)的抗炎介質(zhì)[75]。HO-1 通過(guò)作用相應(yīng)的靶組織胖個(gè)體的早期低度炎癥反應(yīng)，可能成為新的更為有 Nrf2 /ARE 通路的作用化應(yīng)激水平和炎癥水平和表達(dá)的降低可能是改善施。EGCG 具有較強(qiáng)的抗氧化抗炎活性，能夠通過(guò)胞凋亡、抑制脂肪合成和促進(jìn)脂肪分解等機(jī)制發(fā)揮路是最為重要的機(jī)體內(nèi)源性抗氧化和氧化應(yīng)激損傷么，EGCG 是否通過(guò) Nrf2 /ARE 通路來(lái)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)尚無(wú)研究報(bào)道。本研究擬以 3T3-L1 脂肪細(xì)胞為研1 脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥水平的影響，并初步探 Nrf2/HO-1 的作用，為以氧化應(yīng)激和炎癥為靶標(biāo)治論依據(jù)。

本研究擬以 3T3-L1 脂肪細(xì)胞為細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥水平的影響，并初步f2/HO-1 的作用，為以氧化應(yīng)激和炎癥為靶據(jù)。圖 1 Nrf2-ARE 信號(hào)通路圖

中的細(xì)胞長(zhǎng)到 90％左右時(shí)第二次傳代接種另一塊培養(yǎng)板。（4）細(xì)胞凍存收集、離心細(xì)胞同上，以凍存液（含 90%FBS 和 10%DMSO）重懸細(xì)胞沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按 107個(gè)/ml 濃度移入凍存管。將凍存管放入程序冷凍盒中置于-80℃冰箱，24 小時(shí)后放在液氮罐中保存。（5）細(xì)胞分化3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至接觸抑制 2 天后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成分化誘導(dǎo)液 I（含 0.5 mM IBMX、1μM 地塞米松、10 μg/ml 胰島素、10%FBS 的 DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng) 48 小時(shí)后，換以分化誘導(dǎo)液 II（含 10 μg/ml 胰島素、10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液）培養(yǎng) 48 小時(shí)，再換以含 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，天換液一次，當(dāng)誘導(dǎo)分化 8 天的細(xì)胞，在顯微鏡下能看到細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴形成，表明 90%以上呈成熟脂肪細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖 3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 本刊編輯部;俞美玲;趙湘;黃李春;俞敏;章榮華;;專家解讀《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告(2015)》[J];健康博覽;2015年08期

2 張東芳;肖鵬;韓晨露;李衛(wèi)國(guó);王坤英;;表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α和IL-1β基因表達(dá)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2014年04期

3 張江江;賈永芳;李嘉雯;張亞捷;王坤英;李衛(wèi)國(guó);;表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯抑制TNF-α和IL-β在小鼠皮膚燙傷修復(fù)期間的表達(dá)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年02期

本文編號(hào)：2751478