【摘要】：目的:糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一,主要表現(xiàn)為多發(fā)性、對(duì)稱性末端神經(jīng)病變,其發(fā)病機(jī)制尚不明確。中醫(yī)藥在這一領(lǐng)域的研究越來越受到關(guān)注,本研究旨在探討中藥葛根的提取物葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法:觀察RSC96雪旺細(xì)胞的形態(tài)并用免疫細(xì)胞化學(xué)和PCR方法對(duì)其進(jìn)行鑒定;取第3-5代RSC96雪旺細(xì)胞,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),分組如下:空白對(duì)照組(只含有正常培養(yǎng)基,沒有細(xì)胞),正常組(正常培養(yǎng)基+細(xì)胞),模型組(200 m M高糖+1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h),葛根素干預(yù)組(濃度為0.01、0.1、1 m M的葛根素+1640培養(yǎng)基,干預(yù)3 h),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;用JC-1染色法觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化;采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞中NGF蛋白的表達(dá);Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中NGF、caspase-3和AKt、p AKt蛋白的表達(dá)。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)中所用的RSC96雪旺細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后,細(xì)胞生長狀態(tài)及增殖情況良好,細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形,有極狀突起,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)和PCR方法鑒定后,細(xì)胞內(nèi)S-100的表達(dá)為陽性,定位準(zhǔn)確。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:雪旺細(xì)胞培養(yǎng)的第24-72 h生長旺盛,72 h后減緩;與control組相比,高糖模型組中細(xì)胞的增殖率明顯下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與高糖組相比,葛根素各組中細(xì)胞的增殖率均高于模型組,并呈現(xiàn)出濃度依賴,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。JC-1染色結(jié)果:正常雪旺細(xì)胞呈現(xiàn)橙色熒光,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)則逐漸轉(zhuǎn)為綠色熒光。與control組相比,高糖模型組中的細(xì)胞數(shù)明顯減少,且細(xì)胞胞質(zhì)多呈現(xiàn)綠色熒光;與模型組相比,葛根素干預(yù)組中,隨濃度的增加,其細(xì)胞所呈現(xiàn)的綠色熒光逐漸減少,而橙色熒不斷增多。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:與正常組相比,模型組中NGF蛋白陽性表達(dá)較正常組顯著下降(P0.01);與模型組相比,經(jīng)葛根素預(yù)保護(hù)處理后,NGF蛋白陽性表達(dá)情況有所逆轉(zhuǎn)(P0.05);而葛根素的各濃度組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western Blot結(jié)果:與正常組相比,模型組中NGF蛋白的表達(dá)量明顯減少(P0.05);與模型組相比,葛根素干預(yù)組中NGF蛋白的表達(dá)量升高,尤其是葛根素高濃度組(1 m M)差異顯著(P0.01)。與正常組相比,模型組中caspase-3蛋白的表達(dá)量顯著增加(P0.05);而與模型組相比,葛根素干預(yù)組中caspase-3蛋白的表達(dá)量明顯減少,以高濃度組(1mM)呈現(xiàn)顯著差異(P0.01)。與正常組相比,經(jīng)濃度為200 m M的高糖處理后,pAkt蛋白的表達(dá)降低,差異有顯著性(P0.05);用1 mM的葛根素干預(yù)后,pAkt蛋白的表達(dá)較高糖組增高(P0.01),而在PI3K抑制劑LY2940002處理組,pAkt蛋白的表達(dá)情況較葛根素組有所逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:高糖能明顯抑制雪旺細(xì)胞的增殖,且與葡萄糖的濃度呈負(fù)相關(guān);葛根素能夠抑制高糖誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡,促進(jìn)RSC96細(xì)胞中NGF蛋白的表達(dá),抑制caspase-3的酶活性;葛根素能夠促進(jìn)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化,且這種作用可被P13K的抑制劑LY294002所阻斷,說明葛根素在此發(fā)揮作用的可能機(jī)制是通過激活PI3K/AKt信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：湖北民族學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

篩查異常值并查找輸入錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)，根據(jù)原始記錄重新輸入。分析前采用 One Sample Kolmoglrov-smirnov Z test 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）描述，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法（k 個(gè)獨(dú)立樣本的檢驗(yàn)）。各種檢驗(yàn)的顯著性水平均設(shè)定為 P≤0.05。3 結(jié)果3.1 RSC96 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果正常的雪旺細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形，少數(shù)細(xì)胞呈三角形或不規(guī)則狀，有兩個(gè)細(xì)長的軸狀突起，細(xì)胞核呈卵圓形。本實(shí)驗(yàn)中所購的 RSC96 雪旺細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)后，細(xì)胞生長狀態(tài)及增殖情況良好，細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，有極狀突起（見圖 3-1）。

A:Control B:S-100(+)圖 3-2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) RSC96 細(xì)胞內(nèi) S-100 蛋白的表達(dá)3.2.2 PCR 鑒定結(jié)果經(jīng) 溫 度 梯 度 PCR 實(shí) 驗(yàn) ， 設(shè) 置 S-100 的 引 物 序 列 （ S100b-Rat-314-F; 5'CACCCGAAGAGGTTGGCT 3'S100b-Rat-314-R: 5' CCTCTGTCCGTGTCCTATGG 3'），設(shè)定了三個(gè)溫度梯度（61℃/63℃/65℃），共設(shè)置 28 個(gè)循環(huán)。其結(jié)果顯示 S-100的表達(dá)呈陽性[52]，定位準(zhǔn)確，細(xì)胞確定為雪旺細(xì)胞株無誤（見圖 3-3）。

A:Control B:S-100(+)圖 3-2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) RSC96 細(xì)胞內(nèi) S-100 蛋白的表達(dá)3.2.2 PCR 鑒定結(jié)果經(jīng) 溫 度 梯 度 PCR 實(shí) 驗(yàn) ， 設(shè) 置 S-100 的 引 物 序 列 （ S100b-Rat-314-F; CACCCGAAGAGGTTGGCT 3'S100b-Rat-314-R: 5' CCTCTGTCCGTGTCCTATGG 3'）設(shè)定了三個(gè)溫度梯度（61℃/63℃/65℃），共設(shè)置 28 個(gè)循環(huán)。其結(jié)果顯示 S-10的表達(dá)呈陽性[52]，定位準(zhǔn)確，細(xì)胞確定為雪旺細(xì)胞株無誤（見圖 3-3）。

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本文編號(hào)：2750898