【摘要】：目的還貝止咳方為山西省中醫(yī)院臨床經(jīng)驗方,對于治療小兒咳嗽變異性哮喘療效顯著。為了闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究采用譜效相關(guān)性分析及血清藥物化學對還貝止咳方止咳作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究,為該方的新藥研發(fā)及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。方法1.基于譜效關(guān)聯(lián)技術(shù)對還貝止咳方止咳作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究。以咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)和以小鼠肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量為考察指標,對還貝止咳方水提物、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層的止咳作用進行研究;采用高效液相色譜法建立還貝止咳方不同極性部位的HPLC指紋圖譜,將不同極性部位的圖譜進行對比,以水提物圖譜為參照,得到各部位指紋圖譜的共有峰和相應的峰面積;采用雙變量相關(guān)分析將藥效學實驗數(shù)據(jù)與共有峰面積進行關(guān)聯(lián);基于單味藥及對照品的HPLC圖譜對關(guān)聯(lián)度較高的色譜峰進行歸屬和指認。2.基于血清藥物化學技術(shù)對還貝止咳方止咳作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究。采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法建立還貝止咳方體外供試品溶液在正、負離子模式模式下的總離子流圖,利用準分子離子峰、碎片離子等信息,對比數(shù)據(jù)庫及現(xiàn)有文獻對分離出的化合物進行推測和鑒定;在相同條件下建立還貝止咳方含藥血清及空白血清的總離子流圖,將二者的差異圖譜與體外供試品溶液的總離子流圖進行對比研究,對還貝止咳方入血成分進行推測和表征。結(jié)果1.譜效相關(guān)性研究(1)不同極性部位止咳活性研究與空白組相比,模型組肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量均顯著升高(P0.05),說明造模成功。與模型組相比,水提物、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層對于小鼠咳嗽次數(shù)、肺灌洗液中的IL-4、IFN-γ、IL-5及IgE的含量均有下調(diào)趨勢,且均可以延長小鼠的咳嗽潛伏期,提示還貝止咳方水提物、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層對于小鼠咳嗽均具有一定的治療作用。(2)不同極性部位指紋圖譜的建立通過對供試品制備條件及色譜條件進行優(yōu)化,建立還貝止咳方水提物的HPLC特征圖譜,并進行方法學考察,證明該方法穩(wěn)定可行。在相同條件下建立其不同極性部位的指紋圖譜,以水提物圖譜為參照,經(jīng)色譜工作站處理,得到各部位指紋圖譜的共有峰和相應的峰面積,其中,水提物共有46個共有峰,乙酸乙酯層有45個共有峰,正丁醇層有43個共有峰,水層有3個共有峰。(3)不同極性部位止咳作用的譜效相關(guān)性分析通過雙變量相關(guān)分析表明,有7個色譜峰的含量與咳嗽潛伏期呈顯著正相關(guān)性,分別為12、13、29、32、33、35、39號峰,其中32號峰具有極顯著性意義;有4個色譜峰的含量與咳嗽次數(shù)呈顯著負相關(guān)性,分別為12、13、32、33號峰,其中13、32號峰具有極顯著性意義,表明這7個峰對于還貝止咳方止咳作用發(fā)揮的貢獻較大。此外,還有15個色譜峰與藥效學實驗結(jié)果相關(guān)性也較強,分別為1、5、6、8、9、10、18、19、20、21、23、36、38、40、41號峰,但不具有顯著性意義,說明這些成分對該方的止咳作用也具有一定的貢獻。(4)基于單味藥及對照品指認分析活性成分通過與方中各單味藥的HPLC圖譜進行對比,對共有峰進行歸屬,并通過對照品進一步指認,證明方中5、9、12、14、17、24、25、26、27、33、44、46號峰分別為新綠原酸、苦杏仁苷、綠原酸、咖啡酸、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素。其中新綠原酸、苦杏仁苷、綠原酸和黃芩苷為譜效相關(guān)性研究中與該方止咳作用相關(guān)性較高的峰,且綠原酸和黃芩苷具有顯著相關(guān)性。2.血清藥物化學研究(1)體外化學成分的定性分析通過數(shù)據(jù)庫比對及文獻查閱,還貝止咳方體外供試品溶液共分離出化合物68種,推測和鑒定出64種,包括黃酮類化合物38個,有機酸類化合物10個,萜類化合物6個,含氮化合物10個,其中10個化學成分經(jīng)對照品確證。(2)入血成分分析通過對空白血清及含藥血清圖譜進行比對,生成的差異圖譜中共顯示入血成分28種,通過與還貝止咳方體外供試品總離子流圖進行比較,其中9種為原型成分,19種為代謝產(chǎn)物。結(jié)合現(xiàn)有文獻報道,共推測及指認出24中成分,其中大部分為黃酮類及有機酸類化合物的原型及代謝產(chǎn)物。結(jié)論采用譜效相關(guān)性研究及血清藥物化學兩種不同的方法從不同的角度闡明還貝止咳方止咳作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為黃酮類及有機酸類化合物,為該方新藥研發(fā)、質(zhì)量控制等奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

技術(shù)路線圖

圖 3 還貝止咳方 HPLC 對照指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint of Huanbei Zhike Formula3.2 還貝止咳方不同極性部位指紋圖譜以還貝止咳方水提物圖譜為參照，經(jīng)色譜工作站處理，得到各不同極性部位

不同批次特征圖譜匹配Fig.2Characteristicatlasmatchingofdifferentbatches

【參考文獻】

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本文編號：2750765