【摘要】：目的:黃柏是一種常用中藥,在我國分布廣泛、資源豐富,在《中國藥典》中黃柏的活性成分檢測包括小檗堿和黃柏堿,但是在工業(yè)生產上黃柏常常作為提取小檗堿的主要原料,而含有黃柏堿的工業(yè)廢水排放到環(huán)境中造成了大量的浪費和污染。本課題主要是模擬工業(yè)生產對黃柏提取小檗堿后的廢液進行黃柏堿的回收提取工藝研究,并且對黃柏堿進行了系統(tǒng)的抗氧化活性及其相關機制研究,其意義在于加強黃柏資源的合理利用以及環(huán)境保護作用,同時為黃柏堿的臨床開發(fā)應用提供理論依據。方法和結果:(1)本研究采用工業(yè)上常用的大孔樹脂進行黃柏堿進行富集,然后采用反相硅膠柱層析進行分離純化,整個過程使用TLC鑒別和HPLC進行含量和純度的分析。結果顯示,流出液的體積在5.5BV時黃柏堿開始出現滲漏,因此最大上樣量為5BV;黃柏堿通過大孔樹脂富集回收后的純度約為70%,回收率為71.76%;反相硅膠柱層析采用甲醇-水梯度洗脫,用60%的甲醇加少量濃氨水能夠迅速將大部分黃柏堿洗脫下來,減壓濃縮后加一定量的甲醇置4℃冰箱中結晶,經HPLC分析純化后的黃柏堿純度可達到90%,將此結晶加少量濃鹽酸溶解后再加適量甲醇進行重結晶可得純度為98%以上的黃柏堿單體,最后的整體回收率約35.59%。(2)黃柏堿進行體外抗氧化活性分析主要采用了化學分析法以及熒光分光光度法。在體外實驗中發(fā)現黃柏堿有較好的清除ABTS+、DPPH自由基、O2.-的作用,并且在相同濃度下黃柏堿清除DPPH的能力比小檗堿強;本實驗還利用A549細胞模型評價了黃柏堿清除ROS的能力,結果顯示黃柏堿的濃度為5、25μg/ml時在細胞中有顯著的清除ROS的作用。(3)以斑馬魚胚胎為模型對黃柏堿進行體內抗氧化活性分析,主要采用DCFH-DA、DPPP、AO熒光染料處理后再用熒光顯微鏡拍照并分析熒光強度。結果顯示不同濃度的黃柏堿對由AAPH引起的斑馬魚胚胎死亡以及心跳異常等現象均有較好的保護效果,特別是200μg/ml的黃柏堿能夠在72h時將斑馬魚胚胎的存活率提高到90.26±1.40%;此外,黃柏堿在斑馬魚體內還具有較好的清除ROS,降低脂質過氧化以及細胞死亡率的效果,特別是在清除ROS方面呈現劑量依賴關系。(4)分別以斑馬魚胚胎和A549細胞為模型對黃柏堿的抗氧化機制進行研究,主要使用了RT-PCR以及蛋白免疫印跡法分別對抗氧化通路上的關鍵基因和蛋白進行了檢測。結果顯示,在斑馬魚體內100μg/ml的黃柏堿能夠顯著提高AKT、Nrf2、HO-1和Bcl-2基因的表達而對NF-κB和P53基因具有下調的作用;通過WB分析發(fā)現黃柏堿能夠抑制AKT以及NF-κB的磷酸化作用,加入通路抑制劑LY294002和BAY11-7082后能夠顯著抑制AKT和NF-κB對應的下游蛋白的表達,而黃柏堿與此有相同的作用。結論:在對黃柏堿的回收提取過程中主要采用了醫(yī)藥工業(yè)上常用的大孔樹脂和C18硅膠填料,在洗脫劑方面主要使用的是乙醇、甲醇和水,它們廉價易得且回收方便對環(huán)境污染少。此外研究顯示黃柏堿在體內外均具有較好的抗氧化作用,體外抗氧化活性評價發(fā)現黃柏堿清除DPPH自由基的效果比小檗堿強。機制研究發(fā)現黃柏堿在斑馬魚胚胎體內主要是激發(fā)了AKT/Nrf2/HO-1這一關鍵性的抗氧化防御系統(tǒng),從而達到清除ROS的作用,提高了胚胎的存活率。由于NF-κB不僅與氧化應激相關而且還是炎癥反應的重要通路,因此在A549細胞中對這一通路進行了深入研究,結果發(fā)現黃柏堿能夠抑制ROS引起的炎癥通路上相關蛋白的表達主要是通過抑制IKK/NF-κB通路來實現的,同時它還能夠顯著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表達。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2750738