【摘要】：目的:本實驗選用人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T)作為研究對象,研究赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)對細(xì)胞形態(tài)、活性氧水平、自噬相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的影響。并探討齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)不同干預(yù)方式對OTA暴露后HEK293T細(xì)胞自噬及凋亡的影響。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T)培養(yǎng),貼壁生長后取對數(shù)生長期細(xì)胞傳代培養(yǎng)后用于后續(xù)實驗。2.分組處理:實驗分為6組,對照組、OTA組、OA組、OA預(yù)處理組(即P組,OA先處理+OTA后處理)、OA與OTA同時處理組(即M組),OA后處理組(即L組,OTA先處理+OA后處理)。OTA處理細(xì)胞24小時,OA處理細(xì)胞2小時。分組處理完成后收集細(xì)胞檢測。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧水平:分組處理后,收集細(xì)胞,加入DCFH-DA探針,無血清培養(yǎng)基洗滌三次,流式細(xì)胞儀檢測。4.蛋白免疫印記(Western blot):分組處理后提取細(xì)胞蛋白,BCA法測定濃度,檢測相關(guān)蛋白的表達情況。5.數(shù)據(jù)處理:采用SPSS18.0軟件,結(jié)果描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,多組間均數(shù)比較時,滿足方差齊性檢驗,采用單因素方差分析,并采用SNK法進行兩兩比較。p0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.CCK8法結(jié)果提示:OA濃度選擇,與對照組比較,OA(1μΜ)明顯促進HEK293T細(xì)胞的增殖(P0.05)。分組處理中,與OTA組比較,OA預(yù)處理組(P組)、OA與OTA同時處理組(M組)、OA后處理組(L組)細(xì)胞存活率均增加(P0.05)。2.倒置顯微鏡下觀察到:與對照組比較,OTA(8μM)處理24小時后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,部分細(xì)胞由梭形變成圓形,邊緣不清晰,細(xì)胞皺縮。與OTA組比較,OA后處理組細(xì)胞皺縮情況改善。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示:與對照組相比,OTA組細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高(P0.05)。與OTA組比較,P組和L組ROS含量顯著降低(P0.05),M組ROS含量降低但無顯著差異(P0.05)。4.Western blot結(jié)果提示:與對照組比較,OTA組HEK293T細(xì)胞內(nèi)的p-m TOR和p-p70s6k的磷酸化水平降低(P0.05),LC3-II和P-Beclin1的蛋白表達增加(P0.05)。與OTA組比較,OA干預(yù)后p-m TOR和p-p70s6k磷酸化水平增加,LC3B和p-Beclin1的表達降低(P0.05),其中OA后處理方式效果較好。5.Western blot結(jié)果提示:與對照組相比,OTA組Caspase-9、Bak、Bax、Cyt C蛋白表達量增加(P0.05)。與OTA組比較,P組、M組和L組的Bak、Cyt C表達量降低(P0.05),M組和L組Bax表達量降低(P0.05)。結(jié)論:1.OA可以降低OTA誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。2.OA通過p-m TOR/p-p70s6k/p-Beclin1/LC3B信號降低OTA誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平,OA后處理效果較好。3.OTA誘導(dǎo)的自噬在一定程度上抑制了細(xì)胞的過度凋亡。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

前 言由絲狀真菌種產(chǎn)生的曲霉菌屬和青霉屬的次赭曲霉毒素 A、B、C，其中赭曲霉毒素 A（，僅次于黃曲霉素。OTA 是一個慢性毒素，農(nóng)產(chǎn)品（谷物、咖啡、可可、干果、香料的谷類、水果、動物飼料的污染物[2]。OTA，很少的游離部分能夠排出體外，這些都將 OTA 暴露能夠?qū)е赂文I毒性[4]，甚至致畸，明，OTA 暴露與巴爾干地方性腎病有關(guān)[5-7]，通過調(diào)節(jié)不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞持甲基化結(jié)構(gòu)形態(tài)[9]而損傷腎細(xì)胞。目前赭曲待進一步研究。

圖 1-2 OA 的分子結(jié)構(gòu): Chemical structures of Oleanolic acid一些腎臟疾病的發(fā)病機制，例如巴的腎腫瘤[21,22]、突尼斯[23]和其他癥研究機構(gòu)（IARC）的數(shù)據(jù)表明許多食品和飼料中，被美國國家癌齒動物中最有效的腎臟致癌物之一 OTA 的積累、抑制 OTA 的攝取。亡、自噬性死亡、壞死三種類別態(tài)下細(xì)胞自噬水平較低，在存在細(xì)胞死亡。自噬的三種類型（大大自噬。大自噬負(fù)責(zé)降解受損細(xì)

圖 2：不同濃度 OA 處理后細(xì)胞存活率（ ±s，n=5）ge viability of cells exposed to OA over 2 h. Different lowercase significant differences (P < 0.05)的細(xì)胞存活率理方式下對細(xì)胞存活率的影響，CCK8 檢測對照組、O 組細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示：與對照組比較，OTA 組TA 組比較，OA 干預(yù)后的三種處理方式增加細(xì)胞活）（圖 3-A）。M 組細(xì)胞存活率最高，推測原因是與 P ，細(xì)胞丟失少，整體活性增加。析因結(jié)果顯示：OTA具有交互作用，（F=34.587，P<0.001）（圖 3-B）。

【參考文獻】

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本文編號：2750572