【摘要】：目的觀察含有黃芪、當(dāng)歸、白芷、皂角刺4味藥物的托里消毒散精簡(jiǎn)方對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面血管新生的影響;分析方中所含有的化學(xué)成分,明確該方藥效物質(zhì);運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討該方促糖尿病大鼠創(chuàng)面血管新生的靶點(diǎn)與潛在作用機(jī)制并進(jìn)行驗(yàn)證。方法1.通過(guò)尾靜脈單次大劑量注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,背部皮膚打孔法制備糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷動(dòng)物模型,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型組(DM組)及托里消毒散精簡(jiǎn)方治療組(DM+TLXDS組)。計(jì)算創(chuàng)傷后5d、8d、11d、14d各組大鼠創(chuàng)面愈合率。分別取創(chuàng)傷后5d、8d、11d、14d各組大鼠創(chuàng)面組織,HE染色觀察創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)創(chuàng)傷5d后創(chuàng)面組織中Ki67及CD31的表達(dá)情況。2.UPLC-Q-TOF/MS對(duì)托里消毒散精簡(jiǎn)方中所含有的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析。分子對(duì)接技術(shù)對(duì)藥物作用的靶蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè),Uniprot、KEGG等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶蛋白的功能及通路進(jìn)行注釋,利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-功能網(wǎng)絡(luò)圖。3.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的藥物成分對(duì)細(xì)胞活性的影響;應(yīng)用Western Blotting法檢測(cè)藥物成分對(duì)血管新生相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.各組大鼠創(chuàng)面愈合率:大鼠造模后,DM組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率均低于NC組(P0.05),DM+TLXDS組大鼠創(chuàng)面愈合率在給藥2天后即明顯高于DM組,在藥物干預(yù)期間糖尿病各組大鼠血糖均未見明顯差異。2.創(chuàng)面新生血管生成情況:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示與NC組大鼠相比,DM組創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67和血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物CD31表達(dá)均明顯降低,DM+TLXDS組大鼠創(chuàng)面中Ki67及CD31的表達(dá)較DM組明顯增多。二、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果1.UPLC-Q-TOF/MS藥物成分分析:在正、負(fù)離子模式下從托里消毒散精簡(jiǎn)方醇提物中共指認(rèn)出包含黃酮、皂苷、香豆素、甾體類及萜類等成分的28個(gè)化合物。2.分子對(duì)接及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析:分子對(duì)接結(jié)果表明方中所含有的17個(gè)化合物可與17個(gè)靶蛋白相互作用,成分-靶點(diǎn)關(guān)系共計(jì)210對(duì)。其中與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的靶點(diǎn)5個(gè),與抗菌、抗炎作用相關(guān)的靶點(diǎn)6個(gè),與細(xì)胞分化相關(guān)的靶點(diǎn)6個(gè),與細(xì)胞遷移相關(guān)的靶點(diǎn)10個(gè),與血管新生相關(guān)的靶點(diǎn)6個(gè),與上皮生長(zhǎng)因子刺激相關(guān)的靶點(diǎn)2個(gè),與血管的舒張功能相關(guān)的靶點(diǎn)6個(gè),與雌激素相關(guān)的靶點(diǎn)2個(gè)。進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示托里消毒散精簡(jiǎn)方中所包含的黃酮、皂苷、香豆素、甾體類及萜類成分可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-kB、MAPK、PI3K、ERK2等靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)節(jié)NF-kB、PI3K/Akt/eNOS、MAPK等相關(guān)信號(hào)通路從而共同產(chǎn)生抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及促血管新生等生物學(xué)效應(yīng)。三、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果黃芪皂苷IV、毛蕊異黃酮、紫花前胡苷對(duì)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響:Western Blotting結(jié)果顯示黃芪皂苷IV增加了HUVEC中PI3K蛋白的表達(dá)水平,紫花前胡苷可調(diào)節(jié)其下游Akt蛋白的磷酸化水平,毛蕊異黃酮?jiǎng)t可調(diào)節(jié)eNOS蛋白的磷酸化水平。結(jié)論1.托里消毒散精簡(jiǎn)方可通過(guò)促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的血管新生有效改善創(chuàng)面的愈合。2.托里消毒散精簡(jiǎn)方中黃酮、皂苷、香豆素、甾體類及萜類成分可能為該方主要的藥效物質(zhì),這些成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、抗炎、促血管新生等作用進(jìn)而促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合。3.黃芪皂苷IV、毛蕊異黃酮及紫花前胡苷對(duì)PI3K/AKt/eNOS通路相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)可能為該方促創(chuàng)面血管新生的分子機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

2圖 1 創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程1.2 糖尿病創(chuàng)面愈合受損內(nèi)源性的病理異常與外在因素（感染、壓力等）共同導(dǎo)致了糖尿病創(chuàng)面復(fù)雜的微環(huán)境[8]。大量的文獻(xiàn)資料均證實(shí)了糖尿病創(chuàng)面修復(fù)能力下降、愈合延遲[9-11]。糖尿病異常的血流動(dòng)力學(xué)首先會(huì)引起微循環(huán)的障礙，長(zhǎng)期慢性的高糖環(huán)境導(dǎo)致微血管形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的異常，其中以毛細(xì)血管基底膜增厚、管腔縮小及周細(xì)胞的退化、缺失為主要表現(xiàn)[12]。增厚的基底膜降低了白細(xì)胞的遷移，增加了糖尿病創(chuàng)面對(duì)感染的易感性。此外，血管結(jié)構(gòu)的改變同樣降低毛細(xì)血管壁的彈性，影響了血管的舒張能力。在長(zhǎng)期的高糖環(huán)境中細(xì)胞代謝及功能發(fā)生紊亂，皮膚中非酶促糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物 AGEs 含量增多，其經(jīng)與受體 RAGE 相結(jié)合可引起一系

圖 1.2.3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率1.2.4 大鼠創(chuàng)面組織 HE 染色各組大鼠取創(chuàng)傷后 5、8、11、14 天創(chuàng)面組織進(jìn)行觀察，鏡下 HE 染色顯示創(chuàng)傷后 5 天 NC 組大鼠創(chuàng)面新生血管旺盛；DM 組創(chuàng)面可見一層細(xì)胞核致密的炎癥壞死組織，下方新生血管較少；DM+TLXDS 組創(chuàng)面血管新生較為豐富。創(chuàng)傷后第 8 天 NC 組大鼠創(chuàng)面炎性細(xì)胞漸消退，新生血管向創(chuàng)面表層延伸，管腔內(nèi)含有大量的紅細(xì)胞，新生表皮漸向創(chuàng)面中央爬行；DM 組較 NC 組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)仍重，但新生血管變得豐富，管腔較大，大量的紅細(xì)胞位于管腔中，表皮修復(fù)較差。DM+TLXDS 組創(chuàng)面中血管漸向表層延伸，管腔中有較多的紅細(xì)胞，新生表皮變厚。創(chuàng)傷后 11 天 NC 組大鼠創(chuàng)面血管漸閉合、退化，血管數(shù)較 8 天時(shí)少，大部分創(chuàng)面被成纖維細(xì)胞所合成的膠原基質(zhì)成分所替代；DM 組大鼠創(chuàng)面仍遺留有部分炎性細(xì)胞，新生血管較 8 天時(shí)少，血管向表層延伸，血管中的紅細(xì)胞數(shù)量變少，表皮修復(fù)程度差于 NC 組；DM+TLXDS 組大鼠創(chuàng)面可見散在炎性細(xì)胞，創(chuàng)面中新生血管漸向表層延伸，管腔縮小，表皮修復(fù)較佳。創(chuàng)傷后 14 天 NC 組創(chuàng)面可見大量的膠原基質(zhì)成分，血管數(shù)進(jìn)一步減少，表皮變厚；DM 組仍有大部分

創(chuàng)面未被修復(fù)，創(chuàng)面中漸向表層延伸的血管數(shù)增加，大部分管腔中未見明顯的紅細(xì)胞，創(chuàng)面膠原基質(zhì)成分沉積欠佳；DM+TLXDS 組創(chuàng)面血管退化，膠原基質(zhì)沉積情況好于模型組，表皮變厚進(jìn)一步覆蓋創(chuàng)面。(結(jié)果見圖 1,2,3,4)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2749814