【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚不明確的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性腸病,以腹痛、腹瀉、粘液膿血便、里急后重等為主要癥狀,屬中醫(yī)“久瀉”、“久痢”、“腸風”等范疇。因其病因不明,發(fā)病環(huán)節(jié)多,纏綿難愈,易癌變,故被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。炎癥性腸病在歐美國家多見,但世界各國均有流行且發(fā)病率呈上升趨勢,我國發(fā)病率也在逐年增加。因此尋找有效的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物更是我們中醫(yī)藥工作者一項重要任務(wù)。固公果是薔薇科薔薇屬植物固公果Rose odorata Sweet var.gigantea(Coll.et Hemsl.)Rehd.et Wils的根,性平、味酸,具有澀腸止瀉的功效,能迅速殺死致病菌,保護消化道黏膜,加快腸壁血液循環(huán),加快潰爛腸黏膜愈合,常用于治療腹瀉、菌痢等疾病,是一味應(yīng)用歷史悠久的彝族民間藥材。目前國內(nèi)外關(guān)于固公果根這味彝族藥物的研究工作主要是我們課題組完成的。前期工作我們通過去粗取精首次確定了固公果根藥材治療腹瀉的有效部位,并在此基礎(chǔ)上首次確定了固公果根提取物能夠有效地治療葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。前期探索性研究還發(fā)現(xiàn)其治療潰瘍性結(jié)腸炎主要通過降低炎癥部位的TNF-a、IL-6的含量,抑制NF-kB的活性,激活Nrf2通路,抵抗炎癥,達到抗炎,治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。因此本項目基于NF-kB/Nrf2通路研究固公果根治療潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎機制和物質(zhì)作用基礎(chǔ)。一、利用動物模型評價固公果根提取物基于Nrf2通路調(diào)節(jié)實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的功效及機制研究選用3%的DSS溶液建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,在給藥后第八天斷頭處死取材(食水重、體重、血樣、脾臟、腸段)。使用試劑盒測定氧化應(yīng)激指標(SOD、MDA、MPO)來評價各組小鼠氧化應(yīng)激指標的變化,發(fā)現(xiàn)與模型組比較,固公果根提取物給藥組的氧化應(yīng)激指標有劑量依賴性的變化,抗氧化能力增強;用ELISA試劑盒測定各細胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,與模型組比較,固公果根提取物給藥組的細胞因子水平顯著性降低,炎癥狀況得到改善;測定各組NOS活力發(fā)現(xiàn)固公果根提取物給藥組的NOS水平隨著劑量的增加而降低,炎癥減輕;測量結(jié)腸長度及測定脾臟重量,固公果根提取物給藥組的結(jié)腸長度有劑量依賴性的增長,且結(jié)腸內(nèi)血樣物質(zhì)減少,脾臟重量降低,炎癥改善;取結(jié)腸組織進行石蠟包埋做HE染色切片,模型組腸壁破壞嚴重,內(nèi)有大量炎性細胞浸潤充血,固公果根提取物給藥組隨著劑量的增加腸壁破壞減輕,炎性細胞浸潤減少,炎癥狀況得到改善;取血清和結(jié)腸勻漿上清液進行Western-Blot法檢測,結(jié)果證明固公果根提取物給藥組能夠發(fā)揮抗氧化作用以達到減輕炎癥的目的,炎癥蛋白NF-kB表達顯著性減低。綜上所述,說明固公果根提取物能夠緩解實驗性潰瘍性結(jié)腸炎,降低潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥狀況。二、利用炎癥細胞體外評價固公果根提取物基于Nrf2通路發(fā)揮抗炎效果及機制研究MTT法測定固公果根提取物對RAW246.7細胞的毒性范圍,1~400μg/mL范圍內(nèi)的固公果根提取物對RAW246.7細胞無明顯的毒性作用,后續(xù)實驗選取100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL三個濃度進行繼續(xù)驗證;使用LPS以TNF-α含量變化為標準建立炎癥模型,確定5μg/mL的LPS刺激RAW246.7細胞;ELISA試劑盒測定細胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,說明固公果根提取物隨著劑量的增加顯著性抑制細胞因子水平,炎癥減輕;NOS活力隨著固公果根提取物劑量的增加而受到抑制,減少了NO促炎因子的釋放;收集各組的細胞蛋白進行Western-Blot法檢測,Nrf2蛋白表達隨著劑量增加而上升,相反的是NF-kB的蛋白表達顯著性降低,結(jié)果說明固公果根提取物能夠增加抗氧化蛋白的表達同時降低了炎癥蛋白的表達;引入NF-kB蛋白抑制劑(BAY 11-7082)檢測各相關(guān)蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)BAY 11-7082不僅能夠抑制NF-kB蛋白的表達,還能夠降低Nrf2蛋白的表達。綜上所述,固公果根提取物能夠抑制LPS誘導的細胞炎癥反應(yīng),且與抗氧化和炎癥通路有關(guān)。三、利用結(jié)腸癌細胞體外評價固公果根提取物基于Nrf2通路促進細胞凋亡及機制研究MTT法檢測固公果根提取物對兩種人結(jié)腸癌細胞活性的影響,固公果根提取物能夠抑制兩種人結(jié)腸癌細胞的增值,選取0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL的固公果根提取物進行后續(xù)實驗的探究;DAPI染料是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料,我們利用DAPI染料觀察細胞核的損傷,固公果根提取物給藥組能夠有劑量依賴性的對結(jié)腸癌細胞核造成損傷;流式細胞術(shù)是當代最先進的細胞定量分析技術(shù)之一,我們利用流式細胞術(shù)檢測固公果根提取物對結(jié)腸癌細胞凋亡率的影響,結(jié)果說明,固公果根提取物能夠增加結(jié)腸癌細胞的凋亡;收集細胞蛋白進行Western-Blot法檢測,發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白Bax隨著加量的增加表達也顯著性增加,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達降低,同時發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞的凋亡與抗氧化蛋白Nrf2相關(guān),細胞凋亡增加而Nrf2蛋白表達顯著性降低,兩種人結(jié)腸癌細胞的結(jié)果一致。綜上所述,固公果根提取物能夠增加人結(jié)腸癌細胞的凋亡率。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生學位論文清測定的結(jié)果與結(jié)腸組織上清液測定結(jié)果保持一致。由圖 2-7 可知，與空白較，模型組的 IL-1 的含量是顯著性升高的現(xiàn)象；與模型組比較，固公果根物給藥組的 IL-1 含量趨勢是隨著劑量的增加表現(xiàn)出顯著性下降趨勢。由圖可知，與空白組比較，模型組中 IL-6 的含量顯著性升高；與模型組比較，固根提取物給藥組是隨著給藥量的增加 IL-6 含量是顯著性降低的趨勢。上述顯示，血清測定的結(jié)果與結(jié)腸組織上清液測定結(jié)果保持一致的趨勢，均說明果根提取物能夠抑制 3%DSS 誘發(fā)的實驗性潰瘍性結(jié)腸炎中血清中、結(jié)腸組的細胞炎癥因子的增加，從而抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。A B

的細胞炎癥因子的增加，從而抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。A B圖 2-6 DSS 誘導潰瘍性結(jié)腸炎處死后取血清與結(jié)腸組織測定 TNF-α 的含量變化Fig2-6 Changes of serum TNF-α and colonic tissue in patients with ulcerative colitis aDSS induced deathC D

圖 2-8 DSS 誘導潰瘍性結(jié)腸炎處死后取血清與結(jié)腸組織測定 IL-6 的含量變化Fig2-8 Changes of serum IL-6 and colonic tissue in patients with ulcerative colitis afteDSS induced deathControl：空白組；Model：模型組；Positive：陽性藥組；CSP：腸舒片組；ROE-L：固公根提取物低劑量組；ROE-M：固公果根提取物中劑量組；ROE-H：固公果根提取物高劑量A、C、E 圖：血清中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量變化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P 0.05,**P < 0.01 vs Model）；B、D、F 圖：結(jié)腸組織勻漿上清液中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量變化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P < 0.05,**P < 0.01 vs Model）2.3.5 NOS、MDA、SOD、MPO 指標的測定取凍存的血清樣本和結(jié)腸組織上清液樣本按照試劑盒說明進行測定，由圖9 可知，與空白組比較，血清和結(jié)腸組織模型組的 NOS 含量都達到較高的水平與空白組有顯著性差異；與模型組比較，血清與結(jié)腸組織的固公果根提取物給組的 NOS 含量隨著劑量的增加是顯著性降低的趨勢。上述結(jié)果說明了固公果提取物能夠有效降低 NOS 活性，抑制 NO 等促炎因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)。

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本文編號：2748806