【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚不明確的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性腸病,以腹痛、腹瀉、粘液膿血便、里急后重等為主要癥狀,屬中醫(yī)“久瀉”、“久痢”、“腸風(fēng)”等范疇。因其病因不明,發(fā)病環(huán)節(jié)多,纏綿難愈,易癌變,故被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。炎癥性腸病在歐美國(guó)家多見,但世界各國(guó)均有流行且發(fā)病率呈上升趨勢(shì),我國(guó)發(fā)病率也在逐年增加。因此尋找有效的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物更是我們中醫(yī)藥工作者一項(xiàng)重要任務(wù)。固公果是薔薇科薔薇屬植物固公果Rose odorata Sweet var.gigantea(Coll.et Hemsl.)Rehd.et Wils的根,性平、味酸,具有澀腸止瀉的功效,能迅速殺死致病菌,保護(hù)消化道黏膜,加快腸壁血液循環(huán),加快潰爛腸黏膜愈合,常用于治療腹瀉、菌痢等疾病,是一味應(yīng)用歷史悠久的彝族民間藥材。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于固公果根這味彝族藥物的研究工作主要是我們課題組完成的。前期工作我們通過(guò)去粗取精首次確定了固公果根藥材治療腹瀉的有效部位,并在此基礎(chǔ)上首次確定了固公果根提取物能夠有效地治療葡聚糖硫酸鈉誘發(fā)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。前期探索性研究還發(fā)現(xiàn)其治療潰瘍性結(jié)腸炎主要通過(guò)降低炎癥部位的TNF-a、IL-6的含量,抑制NF-kB的活性,激活Nrf2通路,抵抗炎癥,達(dá)到抗炎,治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。因此本項(xiàng)目基于NF-kB/Nrf2通路研究固公果根治療潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎機(jī)制和物質(zhì)作用基礎(chǔ)。一、利用動(dòng)物模型評(píng)價(jià)固公果根提取物基于Nrf2通路調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的功效及機(jī)制研究選用3%的DSS溶液建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,在給藥后第八天斷頭處死取材(食水重、體重、血樣、脾臟、腸段)。使用試劑盒測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA、MPO)來(lái)評(píng)價(jià)各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)與模型組比較,固公果根提取物給藥組的氧化應(yīng)激指標(biāo)有劑量依賴性的變化,抗氧化能力增強(qiáng);用ELISA試劑盒測(cè)定各細(xì)胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,與模型組比較,固公果根提取物給藥組的細(xì)胞因子水平顯著性降低,炎癥狀況得到改善;測(cè)定各組NOS活力發(fā)現(xiàn)固公果根提取物給藥組的NOS水平隨著劑量的增加而降低,炎癥減輕;測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度及測(cè)定脾臟重量,固公果根提取物給藥組的結(jié)腸長(zhǎng)度有劑量依賴性的增長(zhǎng),且結(jié)腸內(nèi)血樣物質(zhì)減少,脾臟重量降低,炎癥改善;取結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟包埋做HE染色切片,模型組腸壁破壞嚴(yán)重,內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)充血,固公果根提取物給藥組隨著劑量的增加腸壁破壞減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,炎癥狀況得到改善;取血清和結(jié)腸勻漿上清液進(jìn)行Western-Blot法檢測(cè),結(jié)果證明固公果根提取物給藥組能夠發(fā)揮抗氧化作用以達(dá)到減輕炎癥的目的,炎癥蛋白NF-kB表達(dá)顯著性減低。綜上所述,說(shuō)明固公果根提取物能夠緩解實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎,降低潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥狀況。二、利用炎癥細(xì)胞體外評(píng)價(jià)固公果根提取物基于Nrf2通路發(fā)揮抗炎效果及機(jī)制研究MTT法測(cè)定固公果根提取物對(duì)RAW246.7細(xì)胞的毒性范圍,1~400μg/mL范圍內(nèi)的固公果根提取物對(duì)RAW246.7細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL三個(gè)濃度進(jìn)行繼續(xù)驗(yàn)證;使用LPS以TNF-α含量變化為標(biāo)準(zhǔn)建立炎癥模型,確定5μg/mL的LPS刺激RAW246.7細(xì)胞;ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,說(shuō)明固公果根提取物隨著劑量的增加顯著性抑制細(xì)胞因子水平,炎癥減輕;NOS活力隨著固公果根提取物劑量的增加而受到抑制,減少了NO促炎因子的釋放;收集各組的細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western-Blot法檢測(cè),Nrf2蛋白表達(dá)隨著劑量增加而上升,相反的是NF-kB的蛋白表達(dá)顯著性降低,結(jié)果說(shuō)明固公果根提取物能夠增加抗氧化蛋白的表達(dá)同時(shí)降低了炎癥蛋白的表達(dá);引入NF-kB蛋白抑制劑(BAY 11-7082)檢測(cè)各相關(guān)蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)BAY 11-7082不僅能夠抑制NF-kB蛋白的表達(dá),還能夠降低Nrf2蛋白的表達(dá)。綜上所述,固公果根提取物能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng),且與抗氧化和炎癥通路有關(guān)。三、利用結(jié)腸癌細(xì)胞體外評(píng)價(jià)固公果根提取物基于Nrf2通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究MTT法檢測(cè)固公果根提取物對(duì)兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響,固公果根提取物能夠抑制兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞的增值,選取0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL的固公果根提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的探究;DAPI染料是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料,我們利用DAPI染料觀察細(xì)胞核的損傷,固公果根提取物給藥組能夠有劑量依賴性的對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞核造成損傷;流式細(xì)胞術(shù)是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一,我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)固公果根提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響,結(jié)果說(shuō)明,固公果根提取物能夠增加結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡;收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western-Blot法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白Bax隨著加量的增加表達(dá)也顯著性增加,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達(dá)降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡與抗氧化蛋白Nrf2相關(guān),細(xì)胞凋亡增加而Nrf2蛋白表達(dá)顯著性降低,兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞的結(jié)果一致。綜上所述,固公果根提取物能夠增加人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文清測(cè)定的結(jié)果與結(jié)腸組織上清液測(cè)定結(jié)果保持一致。由圖 2-7 可知，與空白較，模型組的 IL-1 的含量是顯著性升高的現(xiàn)象；與模型組比較，固公果根物給藥組的 IL-1 含量趨勢(shì)是隨著劑量的增加表現(xiàn)出顯著性下降趨勢(shì)。由圖可知，與空白組比較，模型組中 IL-6 的含量顯著性升高；與模型組比較，固根提取物給藥組是隨著給藥量的增加 IL-6 含量是顯著性降低的趨勢(shì)。上述顯示，血清測(cè)定的結(jié)果與結(jié)腸組織上清液測(cè)定結(jié)果保持一致的趨勢(shì)，均說(shuō)明果根提取物能夠抑制 3%DSS 誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎中血清中、結(jié)腸組的細(xì)胞炎癥因子的增加，從而抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。A B

的細(xì)胞炎癥因子的增加，從而抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。A B圖 2-6 DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎處死后取血清與結(jié)腸組織測(cè)定 TNF-α 的含量變化Fig2-6 Changes of serum TNF-α and colonic tissue in patients with ulcerative colitis aDSS induced deathC D

圖 2-8 DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎處死后取血清與結(jié)腸組織測(cè)定 IL-6 的含量變化Fig2-8 Changes of serum IL-6 and colonic tissue in patients with ulcerative colitis afteDSS induced deathControl：空白組；Model：模型組；Positive：陽(yáng)性藥組；CSP：腸舒片組；ROE-L：固公根提取物低劑量組；ROE-M：固公果根提取物中劑量組；ROE-H：固公果根提取物高劑量A、C、E 圖：血清中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量變化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P 0.05,**P < 0.01 vs Model）；B、D、F 圖：結(jié)腸組織勻漿上清液中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量變化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P < 0.05,**P < 0.01 vs Model）2.3.5 NOS、MDA、SOD、MPO 指標(biāo)的測(cè)定取凍存的血清樣本和結(jié)腸組織上清液樣本按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，由圖9 可知，與空白組比較，血清和結(jié)腸組織模型組的 NOS 含量都達(dá)到較高的水平與空白組有顯著性差異；與模型組比較，血清與結(jié)腸組織的固公果根提取物給組的 NOS 含量隨著劑量的增加是顯著性降低的趨勢(shì)。上述結(jié)果說(shuō)明了固公果提取物能夠有效降低 NOS 活性，抑制 NO 等促炎因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)。

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本文編號(hào)：2748806