【摘要】：目的:抑郁癥是一種典型的精神疾病,其發(fā)病率逐年增加,致殘率高,已成為非常嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。氧化應(yīng)激損傷增加和免疫失調(diào)被認為是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要病理學(xué)機制。巴西蘇木素(Brazilin),是傳統(tǒng)中藥蘇木的主要活性成分,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、血糖調(diào)節(jié)等多種生物活性,考慮到其抗炎和免疫調(diào)節(jié)等活性,我們推測蘇木素可能具有潛在的神經(jīng)保護和抗抑郁作用,目前尚未見蘇木素與應(yīng)激誘發(fā)的神經(jīng)損傷和神經(jīng)行為異常的相關(guān)研究報道。H_2O_2是細胞內(nèi)活性自由基的主要成分之一,外源性H_2O_2常作為細胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑,用于氧化應(yīng)激損傷的體外細胞學(xué)實驗研究。在應(yīng)激致抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程中,中樞相關(guān)腦區(qū)存在氧化應(yīng)激損傷的增加,抗氧化應(yīng)激損傷藥物能夠改善動物的抑郁行為。基于抑郁癥與氧化損傷的相關(guān)聯(lián)系,本實驗綜合利用體外氧化應(yīng)激損傷細胞模型結(jié)合慢性應(yīng)激(chronic mild stress,CMS)小鼠抑郁模型,探討蘇木素處理對氧化應(yīng)激損傷和應(yīng)激誘發(fā)抑郁、焦慮行為的影響,為開發(fā)基于蘇木素的抗抑郁和神經(jīng)保護藥物提供初步實驗依據(jù)。方法:1蘇木素對H_2O_2誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用1.1 MTS法測試不同濃度H_2O_2對體外PC12細胞損傷的影響;1.2 MTS法測試不同濃度蘇木素處理對PC12細胞存活率的影響;1.3 MTS法測定不同濃度蘇木素預(yù)處理對H_2O_2誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用;1.4 Annexin V-FITC/PI法和流式細胞術(shù)檢測蘇木素預(yù)處理對H_2O_2刺激誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和壞死率的影響。2蘇木素處理對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的成年小鼠抑郁行為的影響實驗小鼠隨機分為5組,分別為空白對照組、溶媒對照組、蘇木素給藥組(3 mg/kg、10 mg/kg)、10 mg/kg氟西汀給藥組,每組10只。除空白對照組外其他各組小鼠進行28 d慢性輕度應(yīng)激(小鼠每天隨機進行兩種應(yīng)激處理,應(yīng)激方式包括:24 h傾斜鼠籠、24 h禁食、24 h禁水、4℃冰水游泳5 min、光照過夜、空籠12 h、潮濕墊料12 h、擁擠24 h、束縛2 h、夾尾1 min等),空白組小鼠放置于另外一個房間正常飼養(yǎng)。慢性應(yīng)激第28 d開始,應(yīng)激各組小鼠每日腹腔注射給藥,給藥結(jié)束30 min后行應(yīng)激處理,持續(xù)7 d,末次給藥后24 h開始進行行為學(xué)測試。開場測試設(shè)備為不透明有機玻璃支撐的敞口(40 cm×40 cm)裝置。測試時,將小鼠放置于開場中央?yún)^(qū)域,持續(xù)5 min,采用動物行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)和視頻分析系統(tǒng)(Smart 3.0)記錄5 min內(nèi)小鼠爬格數(shù)和中央停留時間。新穎抑制攝食實驗操作方法為小鼠禁食24 h后放入封閉開場(同開場測試所用敞口裝置)中,中心區(qū)域放鼠糧一顆,從任意箱角放入小鼠,記錄小鼠放入開場到開始吃食的時間,隨后放回籠中,記錄回籠后5 min內(nèi)的食物消耗量,以排除食欲差異對進食時間的影響。糖水偏愛測試分為糖水適應(yīng)和測試兩個階段。糖水適應(yīng)階段,小鼠分籠飼養(yǎng)適應(yīng)48 h,每籠同時給予2個裝有質(zhì)量分數(shù)1%的蔗糖水水瓶,小鼠自由飲水48 h后,進行基礎(chǔ)糖水偏愛測試,小鼠單籠飼養(yǎng),禁食禁水24 h后,同時給予每只小鼠事先量好的1%蔗糖水和純水各1瓶,自由飲水24 h后,分別稱重,計算消耗量,測試期間12 h左右兩水瓶位置互換。糖水偏愛值(%)=蔗糖水攝取量/(飲用水攝取量+蔗糖水攝取量)×100%。結(jié)果:1蘇木素對H_2O_2誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用1.1經(jīng)不同濃度H_2O_2處理PC12細胞,MTS法檢測細胞存活率,確定采用終濃度為200μM的H_2O_2誘導(dǎo)PC12細胞氧化損傷模型;1.2經(jīng)不同濃度蘇木素處理PC12細胞,MTS法檢測細胞存活率,結(jié)果顯示終濃度0-40μM蘇木素處理不顯著影響細胞存活;1.3采用蘇木素預(yù)處理結(jié)合H_2O_2共孵育PC12細胞的方法,MTS法結(jié)果顯示蘇木素在濃度10μM和20μM時可逆轉(zhuǎn)H_2O_2處理誘發(fā)的細胞存活率下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.01),對H_2O_2誘發(fā)的細胞損傷有明顯的保護作用;1.4采用蘇木素預(yù)處理結(jié)合H_2O_2共孵育PC12細胞的方法,Annexin V-FITC/PI法和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示10μM和20μM蘇木素能有效降低H_2O_2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和壞死率,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2蘇木素對應(yīng)激誘導(dǎo)的成年小鼠抑郁行為的影響 行為學(xué)實驗結(jié)果顯示,在不明顯影響總飲水量的情況下,CMS處理后生理鹽水對照組(38.56±4.01%)較空白對照組(60.77±3.62%)的SPT值有明顯差異(P0.01);10 mg/kg蘇木素組(72.06±3.35%)和氟西汀陽性藥物組(73.16±3.52%)均顯著逆轉(zhuǎn)了CMS導(dǎo)致的小鼠蔗糖偏好降低的現(xiàn)象(P0.01),且與空白對照組無明顯差異,顯示出明顯的抗抑郁活性。OFT和NSF的實驗結(jié)果顯示,與空白對照組(60.90±8.43 s,32±2.92 s)相比,CMS處理顯著降低了小鼠在OFT中的中央停留時間(25±2.82 s),明顯延長了在NSF實驗中的攝食潛伏期(76.7±8.26 s),均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);在OFT測試中,3 mg/kg蘇木素(45.3±7.08 s)逆轉(zhuǎn)了CMS導(dǎo)致的小鼠中央停留時間縮短(P0.05);10 mg/kg蘇木素(44.4±8.04 s)及10 mg/kg氟西汀組(53.67±5.88 s)逆轉(zhuǎn)了NSF測試中CMS導(dǎo)致的小鼠攝食潛伏期延長的焦慮樣行為,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.01)表現(xiàn)出了明顯的抗焦慮活性。結(jié)論:體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),10μM和20μM蘇木素能有效逆轉(zhuǎn)H_2O_2導(dǎo)致的PC12細胞凋亡和壞死情況,增加細胞存活,對氧化應(yīng)激誘發(fā)的細胞損傷具有顯著的保護作用。動物行為學(xué)結(jié)果進一步表明,系統(tǒng)給予蘇木素處理能明顯逆轉(zhuǎn)CMS誘發(fā)的抑郁和焦慮行為,表現(xiàn)出明顯的抗抑郁和抗焦慮活性。總之,本研究結(jié)果首次證明蘇木素具有抗抑郁和抗焦慮作用,其抗抑郁和抗焦慮作用可能與其抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 2 不同濃度的 H2O2和蘇木素對細胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of H2O2and hematoxylin on cellviability.Cell viability was detected by MTS assay. Cytotoxic effects of H2O2(A) andbrazilin (B) on PC12 cells. The cells were treated with H2O2for 24 h or withbrazilin for 36 h with the indicated concentrations. All data are expressed asmeans ± SEM and represent three independent experiments. Bars withdifferent characters indicate statistical difference at P<0.05 level.

圖 3 蘇木素抑制 H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細胞的細胞毒性Fig.3 Brazilin suppressed H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells. Morphological observation. Cells after treatment were observed se contrast microscope (×200). (B) Brazilin attenuated H2O2-inrease of cell survive. The PC12 cells were pre-treated with or wilin for 1 h and co-treated with H2O2for another 24 h. All daressed as means ± SD and represent three independent experiments different characters indicate statistical difference at P<0.05 level.

20圖 4 蘇木素對 H2O2誘發(fā)的 PC12 細胞凋亡、壞死的影響Fig.4 Effects of brazilin on H2O2-induced apoptosis and necrosis on PC12cells.(A) PC12 cells were exposed to 200 μM of H2O2and different concentrationsof brazilin for 24h. After the treatment, the staining cells with AnnexinV-FITC and PI-labeling were analyzed by flow cytometric. Apoptotic cells (B)and cell necrosis (C) were analyzed. Results are presented as means ± SEM(n=5). **P<0.01, compared with control group, *P<0.05, compared withH2O2-treated group.

【參考文獻】

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本文編號：2748807