【摘要】：目的:“潤(rùn)腸通便”是當(dāng)歸主要傳統(tǒng)功效之一,歷代本草多有記載,中醫(yī)臨床以其配伍治療血虛便秘療效確切,但藥理機(jī)制不明。本研究通過(guò)建立血虛便秘小鼠模型,并基于結(jié)腸水通道蛋白(AQPs)表達(dá)與便秘的關(guān)系,從宏觀藥效和微觀分子生物學(xué)水平研究探討當(dāng)歸“潤(rùn)腸通便”傳統(tǒng)功效的藥理機(jī)制,詮釋其傳統(tǒng)功效理論的科學(xué)內(nèi)涵。方法:1.中藥治療便秘文獻(xiàn)可視化研究以“中藥”、“中草藥”、“中成藥”、“草藥提取物”、“便秘”為檢索詞檢索相關(guān)期刊論文(1994.1-2016.7)、維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(1989.1-2016.7)、萬(wàn)方數(shù)字化期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(1997.1-2016.7)和中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(1978.1-2016.7),采用BICOMS、g CLUTO和Ucinet軟件對(duì)中藥治療便秘的研究文獻(xiàn)進(jìn)行社會(huì)網(wǎng)絡(luò)可視化分析,以期較全面掌握中藥治療便秘的研究現(xiàn)狀,為本課題的順利實(shí)施提供理論參考。2.血虛便秘小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)(1)皮下注射乙酰苯肼(APH)聯(lián)合腹腔注射環(huán)磷酰胺(CPA)、灌胃復(fù)方地芬諾酯(DPN)、皮下注射APH聯(lián)合腹腔注射CPA并灌胃DPN三種方法分別建立血虛、便秘及血虛便秘小鼠模型,以中醫(yī)血虛便秘證候?yàn)橹饕袛鄻?biāo)準(zhǔn),結(jié)合小鼠外周血液學(xué)指標(biāo)(RBC、WBC、HGB和HCT)和排便情況,對(duì)三種小鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià),同時(shí)用當(dāng)歸對(duì)三種模型進(jìn)行干預(yù)和反證。(2)分析血虛便秘模型小鼠糞便性狀、結(jié)腸含水量、結(jié)腸組織形態(tài)及黏液分泌功能、結(jié)腸AQPs的表達(dá)等宏觀和微觀指標(biāo)的差異化表達(dá),為研究和分析當(dāng)歸“潤(rùn)腸通便”的藥理機(jī)制建立模型準(zhǔn)備。3.當(dāng)歸對(duì)血虛便秘模型小鼠宏觀藥效指標(biāo)的影響96只小鼠按性別、體重隨機(jī)分為正常組、血虛便秘組、陽(yáng)性組和當(dāng)歸高、中、低劑量組,除正常組外,其余各組以APH+CPA+DPN聯(lián)合復(fù)制血虛便秘模型,并以不同劑量當(dāng)歸水煎液予以干預(yù)。觀察各組小鼠一般狀況、糞便性狀、外周血液學(xué)指標(biāo)(RBC、WBC、HGB和HCT)、排便時(shí)間、糞便和結(jié)腸含水量,取結(jié)腸組織進(jìn)行HE和AB-PAS染色,觀察結(jié)腸組織形態(tài)和黏液分泌情況。4.當(dāng)歸對(duì)血虛便秘模型小鼠結(jié)腸AQPs表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的影響建立血虛便秘小鼠模型并以當(dāng)歸進(jìn)行干預(yù),取小鼠結(jié)腸組織,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)檢測(cè)結(jié)腸AQP4和AQP8的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(WB)分別檢測(cè)結(jié)腸AQP4m RNA、AQP8 m RNA和AQP4、AQP8的表達(dá);酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)檢測(cè)結(jié)腸磷脂酶C(PLC)、三磷酸肌醇(IP3)、鈣調(diào)素(Ca M)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、環(huán)磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)水平。5.當(dāng)歸“潤(rùn)腸通便”功效藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步探討建立血虛便秘小鼠模型,以當(dāng)歸水煎液、當(dāng)歸多糖和當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行干預(yù),觀察各組小鼠血虛便秘證候、糞便性狀、外周血RBC、WBC、HGB和HCT、排便時(shí)間、糞便和結(jié)腸含水量等指標(biāo),對(duì)當(dāng)歸“潤(rùn)腸通便”功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行初步探討。結(jié)果:1.目前中藥治療便秘的研究領(lǐng)域主要有:“中藥治療慢傳輸性便秘的基礎(chǔ)與臨床研究”、“中西醫(yī)結(jié)合治療慢性功能性便秘和老年功能便秘的臨床癥狀及療效研究”、“中藥制劑治療習(xí)慣性和老年性便秘的臨床療效觀察”、“瀉下中藥治療腹脹便秘”及“頑固性便秘和腸燥便秘的臨床治療情況研究”等。研究文獻(xiàn)涉及的治療便秘的中藥共有1044種,以當(dāng)歸出現(xiàn)頻次最高(1446),其次為大黃(945)、枳實(shí)(943)、肉蓯蓉(880)、黃芪(846)等。對(duì)出現(xiàn)頻次大于49的95種中藥進(jìn)行社會(huì)網(wǎng)絡(luò)分析,當(dāng)歸處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置,而大黃、肉蓯蓉、厚樸、枳實(shí)、火麻仁、白術(shù)和黃芪處于當(dāng)歸周圍。2.APH聯(lián)合CPA造模、DPN單因素造模均不能建立符合中醫(yī)血虛便秘證候的小鼠模型;APH+CPA+DPN三因素復(fù)合建立的血虛便秘模型小鼠出現(xiàn)蜷縮萎靡、體毛枯疏、光澤暗淡,耳、鼻、唇、尾蒼白,糞便干結(jié)等表現(xiàn),基本能體現(xiàn)中醫(yī)血虛便秘證候;與正常組比較,APH+CPA+DPN三因素建立的血虛便秘模型小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT均顯著降低,排便時(shí)間顯著延長(zhǎng),排便數(shù)量減少,結(jié)腸黏膜和腺體萎縮,黏膜層變薄,黏液分泌減少,結(jié)腸AQP4和AQP8表達(dá)顯著升高。3.三個(gè)劑量(16.67、8.33、4.17g/kg.d)當(dāng)歸水煎液均能改善模型小鼠血虛便秘證候,均能升高血虛便秘小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,縮短排便時(shí)間,升高結(jié)腸含水量;16.67、8.33g/kg.d的當(dāng)歸水煎液均能升高血虛便秘模型小鼠糞便含水量;三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液均能改善血虛便秘模型小鼠的大腸腺萎縮狀況,增加結(jié)腸黏液分泌,改善結(jié)腸潤(rùn)滑功能。4.IHC結(jié)果顯示三個(gè)劑量(16.67、8.33、4.17g/kg.d)當(dāng)歸水煎液均可顯著降低血虛便秘模型小鼠結(jié)腸AQP4和AQP8的表達(dá);RT-PCR分析結(jié)果顯示三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液均能顯著降低血虛便秘模型小鼠結(jié)腸AQP4m RNA和AQP8m RNA的表達(dá);WB分析結(jié)果顯示三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液均能顯著降低血虛便秘模型小鼠結(jié)腸AQP4的表達(dá),16.67、8.33g/kg.d的當(dāng)歸水煎液均能顯著降低模型小鼠結(jié)腸AQP8的表達(dá)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,血虛便秘模型組小鼠結(jié)腸PLC、IP3和Ca M均顯著升高,16.67g/kg.d的當(dāng)歸水煎液組小鼠結(jié)腸PLC顯著降低;三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液組小鼠結(jié)腸IP3均有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液組小鼠結(jié)腸Ca M均顯著降低;血虛便秘模型組小鼠結(jié)腸AC、c AMP和PKA均顯著升高,三個(gè)劑量當(dāng)歸水煎液組小鼠結(jié)腸AC、c AMP和PKA均顯著降低。5.當(dāng)歸水煎液可改善模型小鼠血虛便秘證候,顯著升高小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,顯著縮短排便時(shí)間,升高結(jié)腸和糞便含水量;當(dāng)歸多糖可改善模型小鼠血虛證候,顯著升高模型小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,升高小鼠結(jié)腸含水量,但對(duì)排便時(shí)間無(wú)明顯影響;當(dāng)歸揮發(fā)油可改善模型小鼠便秘證候,顯著縮短模型小鼠排便時(shí)間,升高糞便和結(jié)腸含水量,但對(duì)外周血RBC、WBC、HGB和HCT無(wú)明顯影響。結(jié)論:1.中藥治療便秘的臨床研究較多,基礎(chǔ)研究較少。治療便秘的中藥以復(fù)方為主,當(dāng)歸是最常用的核心中藥之一。2.APH+CPA+DPN三因素聯(lián)合建立的血虛便秘小鼠模型基本能體現(xiàn)中醫(yī)血虛便秘證候,可作為研究血虛便秘的動(dòng)物模型。模型小鼠外周血液學(xué)指標(biāo)、排便時(shí)間、排便數(shù)量、結(jié)腸黏膜、腺體、黏液分泌及黏膜AQP4和AQP8的表達(dá)均有異常改變,可作為研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)。3.當(dāng)歸可明顯改善血虛便秘小鼠的血虛便秘證候、增加結(jié)腸和糞便含水量、軟化糞便、促進(jìn)糞便排出,發(fā)揮其“潤(rùn)腸通便”功效。4.調(diào)節(jié)PLC-IP3-Ca M和AC-c AMP-PKA信號(hào)通路,進(jìn)而影響結(jié)腸AQPs的表達(dá),抑制近端結(jié)腸水分吸收,改善遠(yuǎn)端結(jié)腸黏液的分泌和潤(rùn)滑功能,可能是當(dāng)歸發(fā)揮“潤(rùn)腸通便”傳統(tǒng)功效的重要機(jī)制之一。5.當(dāng)歸多糖和當(dāng)歸揮發(fā)油可能是當(dāng)歸發(fā)揮“潤(rùn)腸通便”功效的重要組分,但尚不能代表當(dāng)歸的整體效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

基于結(jié)腸 AQPs 的表達(dá)研究當(dāng)歸“潤(rùn)腸通便”傳統(tǒng)功效的藥理機(jī)制初步檢索獲得 12906 篇文獻(xiàn)，其中萬(wàn)方數(shù)字化期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 3267 篇，中國(guó)全文數(shù)據(jù)庫(kù) 3315 篇，中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù) 3106 篇，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù) 3218 去重 9313 篇。在閱讀題目和摘要基礎(chǔ)上，排除與本研究納入標(biāo)準(zhǔn)不符的文獻(xiàn) 225 共納入 3368 篇文獻(xiàn)。2.2 年代分布1992 年之前每年發(fā)表中藥治療便秘的研究論文數(shù)量不足 10 篇，1993-2003 年中藥治療便秘的研究論文數(shù)量迅速增長(zhǎng)，且 2003 年文獻(xiàn)量出現(xiàn)第一次高峰（199 篇隨后 2004 年的研究數(shù)量驟降，2006 年文獻(xiàn)量迎來(lái)第二次高峰（222 篇），而 2007-年每年發(fā)表研究數(shù)量介于 153-212 篇之間。結(jié)果見(jiàn)圖 1。

圖 2 中藥治療便秘研究的省份分布Fig. 2 The province distribution of Traditional Chinese Medicine for constipation刊分布8 篇中藥治療便秘的研究文獻(xiàn)刊載在 609 種期刊上，表 1-1 為載文量大療便秘研究期刊一覽表，刊載 19 篇、18 篇、17 篇、16 篇、15 篇、篇、11 篇、10 篇、9 篇、8 篇、7 篇、6 篇、5 篇、4 篇、3 篇、2 篇和分別為 3 種、2 種、3 種、2 種、1 種、2 種、2 種、9 種、3 種、6 種4 種、15 種、25 種、34 種、52 種和 98 種。從期刊的名稱來(lái)看，中醫(yī)冠名中藥、中醫(yī)和中醫(yī)藥的期刊 54 種，由此可見(jiàn)，大部分研究刊載雜志上。載 3368 篇中藥治療便秘研究的前 18 位期刊名稱一覽表[數(shù)量（百分比）]The list of the first 18 journals that published 3368 articles on traditional Chinese Ment of constipation[number(percentage)]期刊名稱 n(%) 序號(hào) 期刊名稱

14 / 124圖 3 發(fā)文量介于 6-21 篇的作者合作社會(huì)關(guān)系圖Fig. 3 The social network diagram of the author cooperative of articles published in the 6-21 作者機(jī)構(gòu)分布及合作關(guān)系共有 1607 個(gè)機(jī)構(gòu)在參與了 3368 篇中藥治療便秘的論文撰寫，共出現(xiàn) 2481 次文數(shù)目最多的機(jī)構(gòu)為上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院、

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2746873