【摘要】：目的:本文旨在分離和純化鹽膚木三萜成分(TER)并探討其通過(guò)作用于結(jié)直腸癌(CRC)酸性代謝產(chǎn)物以及微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用的機(jī)制。方法:將鹽膚木根莖的60%乙醇粗提物分別用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取,選擇1-20min內(nèi)出峰最多的部位進(jìn)一步用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫;MTT法檢測(cè)各洗脫成分的抗腫瘤效應(yīng);MTT法比較正常腸上皮HCoEpiC細(xì)胞和結(jié)腸癌SW620細(xì)胞對(duì)TER的敏感性;流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW620細(xì)胞凋亡情況;同時(shí)采用CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞建立小鼠皮下瘤模型,并給予不同濃度的TER處理,以陽(yáng)性藥5-Fu作為對(duì)照,測(cè)量腫瘤體積并計(jì)算抑瘤指數(shù)。通過(guò)HE染色、免疫組化染色以及Tunnel染色分析小鼠腫瘤組織,觀察TER治療后的腫瘤組織形態(tài)變化、核增殖抗原Ki67的表達(dá)以及小鼠體內(nèi)腫瘤組織凋亡的情況。試劑盒測(cè)定SW620細(xì)胞的葡萄糖攝取率和乳酸生成率;基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)測(cè)定SW620細(xì)胞的侵襲能力;Western blot檢測(cè)SW620細(xì)胞的糖酵解關(guān)鍵酶、H~+交換相關(guān)蛋白以及酸敏感離子通道(ASIC)家族成員的表達(dá);檢測(cè)SW620細(xì)胞中MMPs蛋白的表達(dá),免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中MMP-9蛋白的表達(dá);結(jié)果:HPLC檢測(cè)三萜類成分主要存在于二氯甲烷洗脫部位,但雜質(zhì)較多,主峰不明顯,用二氯甲烷-甲醇進(jìn)一步梯度洗脫后,得到的9號(hào)樣品1-20 min內(nèi)出峰分離度較好,主峰明顯,含有樺木酸濃度為0.528 mg/mL,樺木酮酸濃度為0.632 mg/mL,將9號(hào)樣品作為TER進(jìn)行后續(xù)研究。MTT結(jié)果顯示,TER可以有效抑制HCT116和SW620兩種結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,其抑制HCT116細(xì)胞的IC_(50)值為62.27μg/mL,抑制SW620細(xì)胞的IC_(50)值為53.31μg/mL。但對(duì)正常腸上皮細(xì)胞HCoEpiC無(wú)顯著抑制作用,200μg/mL濃度時(shí)的抑制率僅為32%。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明TER可以有效抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng),HE染色結(jié)果顯示TER可以使腫瘤組織出現(xiàn)損傷和壞死,免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TER下調(diào)腫瘤組織中核增殖抗原Ki67的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示100μg/mL濃度的TER顯著促進(jìn)SW620細(xì)胞凋亡,P0.01,同時(shí)Tunnel染色結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度TER治療后的小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)目增多。TER可以顯著抑制SW620細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(100μg/mL濃度時(shí),P0.001),并下調(diào)糖酵解關(guān)鍵蛋白GLUT1、PKM2和LDHA以及H~+交換相關(guān)蛋白MCT1和NHE1的表達(dá),同時(shí)ASIC2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子(NFAT)通路蛋白的表達(dá)均被下調(diào)。TER處理SW620細(xì)胞后,Western blot檢測(cè)到MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)減少,同時(shí)基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示SW620細(xì)胞的侵襲能力降低;在TER治療后的小鼠腫瘤組織中觀察到MMP-9蛋白的表達(dá)被下調(diào)。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明了從鹽膚木中提取的TER可以通過(guò)靶向CRC酸性微環(huán)境并抑制ASIC2誘導(dǎo)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT途徑,有效抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲,可以作為治療結(jié)直腸癌的輔助療法。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

處理人結(jié)腸癌 HCT116 細(xì)胞 24 小時(shí)，如圖 2.2 A 所示，2 號(hào)，9 號(hào)，11 號(hào)，13號(hào)，18 號(hào)，75 號(hào)，82 號(hào)和 88 號(hào)對(duì) HCT116 細(xì)胞增殖呈現(xiàn)較好的抑制效果。接著用這8個(gè)組分處理SW620細(xì)胞24小時(shí)，從圖2.2 B可以看出9號(hào)樣品對(duì)SW620細(xì)胞的抑制效果明顯優(yōu)于其他幾個(gè)組分，并且在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基稀釋后 9 號(hào)能夠較好地分散于培養(yǎng)基中，因此我們選擇了 9 號(hào)組分作為鹽膚木總?cè)瞥煞郑═ER）進(jìn)行后續(xù)的研究。如圖 2.2 C 所示，用倒置顯微鏡觀察 TER 處理后的 SW620 細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少并且出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞逐漸皺縮變圓。A

162.4 本章小結(jié)本章研究首先通過(guò)乙醇回流方法對(duì)鹽膚木進(jìn)行粗提后用乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷萃取，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，并根據(jù)其峰形調(diào)整流動(dòng)相確定HPLC色譜條件。采用HPLC測(cè)定三萜類成分主要存在于二氯甲烷部位，圖 2.3 鹽膚木總?cè)浦械幕瘜W(xué)成分和含量Fig.2.3 Component and Content of triterpenoids of Rhus chinensis Mill（注：（A）鹽膚木總?cè)祁惢衔锏?HPLC 圖譜。（B）樺木酸，樺木醇，樺木酮酸和半乳酸對(duì)照品。）

鹽膚木三萜成分分離及其抗結(jié)直腸癌作用機(jī)制研究R 對(duì)結(jié)直腸癌的細(xì)胞選擇性毒性了研究 TER 是否具有腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性，用不同的濃度的 T結(jié)腸癌 SW620 細(xì)胞與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 HCoEpiC 細(xì)胞 24 h。所示，在25~200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，相同濃度下的TER處理后，細(xì)胞活性顯著高于 SW620 細(xì)胞的活性（P<0.05）,顯示出較低的敏mL 的 TER 作用下， HCoEpiC 細(xì)胞的存活率為 68 %左右， 而存活率僅為 27 %左右。 此結(jié)果說(shuō)明 TER 具有選擇性細(xì)胞毒性細(xì)胞的靶向性。

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本文編號(hào)：2746488