【摘要】：[目的]研究晚期糖基化終末產(chǎn)物對小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及小檗堿對該活化的干預(yù)作用。[方法]1、建立小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型:將小膠質(zhì)細(xì)胞按3×104/mL的密度接種細(xì)胞于96孔板或6孔板內(nèi)爬片上,普通培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞貼壁后更換成不同濃度(100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL,400μg/mL)的 AGEs 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h,MTT法檢測細(xì)胞活力,ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α的分泌情況,細(xì)胞免疫熒光染色法觀察細(xì)胞表面特異性蛋白CD68的表達(dá)以確定最佳藥物濃度。2、建立小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型后,將細(xì)胞分為對照組、AGEs組、小檗堿組,培養(yǎng)24h后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,MTT法檢測細(xì)胞活力,細(xì)胞免疫熒光染色法觀察細(xì)胞表面特異性蛋白CD68的表達(dá),ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α的分泌情況,Western blotting檢測細(xì)胞活化相關(guān)蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]1、AGEs及小檗堿對小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響倒置相差顯微鏡下可見:小膠質(zhì)細(xì)胞約70-80%貼壁生長,胞體呈梭狀或三角狀,約20-30%懸浮生長;AGEs組小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁數(shù)量增多,且隨著AGEs濃度的不斷升高,部分細(xì)胞活化為胞體較大、突起縮短的阿米巴樣類巨噬細(xì)胞。BSA對照組與常規(guī)對照組表現(xiàn)類似。小檗堿干預(yù)后阿米巴樣細(xì)胞數(shù)目減少,多為梭形或三角狀細(xì)胞,提示AGEs能在一定程度上改變小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài),而小檗堿對AGEs導(dǎo)致的形態(tài)學(xué)改變有一定的恢復(fù)作用。2、AGEs及小檗堿對小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響與CON組相比,不同濃度AGEs組及小檗堿組與CON組之間OD值無明顯差異(P0.05)。3、AGEs及小檗堿對小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性蛋白CD68熒光信號的影響FITC通道下觀察:各組特異性的CD68綠色熒光信號均定位于細(xì)胞膜表面,AGEs組與常規(guī)對照組相比,綠色熒光均較對照組弱,其中300μg/mL AGEs組細(xì)胞表面綠色熒光最弱;小檗堿組綠色熒光雖較對照組偏弱,但較AGEs組有所增強(qiáng);陰性對照組細(xì)胞外幾乎見不到綠色熒光。DAPI通道下觀察:各組均可見藍(lán)色熒光的細(xì)胞核。4、AGEs及小檗堿對小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量的影響不同濃度AGEs組細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量分別為1098、1184、1398、1433(單位pg/mL)較對照組61pg/mL顯著升高(P0.001),但各組間TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞.05)。BSA陰性對照組與CON組相比上清液中TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞0.05)。與AGEs組相比,小檗堿組細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞0.05)。5、AGEs及小檗堿對小膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與CON組相比,AGEs組小膠質(zhì)細(xì)胞中CD68、RAGE及p NF-κB p65蛋白的表達(dá)量均明顯升高(P0.01,P0.05,P0.01)。小檗堿組CD68與pNF-κBp65蛋白的表達(dá)量均較AGEs組顯著下降(P0.01,P0.05),RAGE蛋白的表達(dá)量較AGEs組沒有下降(P0.05)。[結(jié)論]1、300μg/mLAGEs培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞24h,在不影響細(xì)胞活力的條件下,可顯著上調(diào)細(xì)胞上清液中的炎性細(xì)胞因子TNF-α的分泌量,同時(shí)可增加CD68、RAGE及p NF-κ Bp65蛋白的表達(dá)。2、小檗堿可以顯著下調(diào)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞CD68和pNF-κBp65蛋白的表達(dá),抑制300μg/mL AGEs培養(yǎng)條件下小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,但對RAGE的表達(dá)沒有影響。[創(chuàng)新點(diǎn)]首次證明AGEs對小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞有活化作用及小檗堿對該活化有干預(yù)作用。這一研究結(jié)果將為闡述小檗堿改善糖尿病認(rèn)知障礙,發(fā)揮腦保護(hù)作用的作用機(jī)制提供支持,為進(jìn)一步尋找治療糖尿病認(rèn)知障礙的中藥提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐碩士研宄生學(xué)位驗(yàn)結(jié)果逡逑同濃度ＡＧＥｓ對小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響逡逑胞貼壁生長后，按實(shí)驗(yàn)分組更換成相應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)２４ｈ后倒置相察細(xì)胞形態(tài)，如圖一所示，鏡下可見：細(xì)胞約７０－８０％貼壁良好，胞角狀，約２０—３０％懸浮生長。不同濃度ＡＧＥｓ千預(yù)２４ｈ后細(xì)胞貼壁數(shù)９０％貼壁，且隨著ＡＧＥｓ濃度的不斷升高，部分細(xì)胞活化為胞體較大阿米巴樣類巨噬細(xì)胞（見圖中紅色箭頭標(biāo)記處）。另外，４００ｐｇ／ｍＬＡ數(shù)凋亡細(xì)胞（見圖中黑色箭頭標(biāo)記處）。以上結(jié)果提示ＡＧＥｓ能在一小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，尤以３0｛＾ｇ／ｍＬＡＧＥｓ組和４００ｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ組形顯，但４００（ａｇ／ｍＬＡＧＥｓ可能對細(xì)胞已產(chǎn)生毒性損傷作用。逡逑

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圖２邋ｌＯＯｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ培養(yǎng)２４ｈ后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)：胞體大多呈梭狀，逡逑貼壁細(xì)胞較常規(guī)培養(yǎng)組增多；仍可見少數(shù)懸浮細(xì)胞逡逑＇邋？＇邋－邋．．．邋｜逡逑－－邐．．．邋＊邋ｖ邋－邋－邋＇邋＊＇？逡逑？邐！邋４Ｔ：邋■邋■邐．邋■．逡逑？邋＇邋．逡逑？逡逑２００Ａ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2746248