【摘要】：[目的]研究晚期糖基化終末產物對小鼠小膠質細胞的活化及小檗堿對該活化的干預作用。[方法]1、建立小膠質細胞活化模型:將小膠質細胞按3×104/mL的密度接種細胞于96孔板或6孔板內爬片上,普通培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,待細胞貼壁后更換成不同濃度(100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL,400μg/mL)的 AGEs 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h,MTT法檢測細胞活力,ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α的分泌情況,細胞免疫熒光染色法觀察細胞表面特異性蛋白CD68的表達以確定最佳藥物濃度。2、建立小膠質細胞活化模型后,將細胞分為對照組、AGEs組、小檗堿組,培養(yǎng)24h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化,MTT法檢測細胞活力,細胞免疫熒光染色法觀察細胞表面特異性蛋白CD68的表達,ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α的分泌情況,Western blotting檢測細胞活化相關蛋白的表達。[結果]1、AGEs及小檗堿對小膠質細胞形態(tài)的影響倒置相差顯微鏡下可見:小膠質細胞約70-80%貼壁生長,胞體呈梭狀或三角狀,約20-30%懸浮生長;AGEs組小膠質細胞貼壁數量增多,且隨著AGEs濃度的不斷升高,部分細胞活化為胞體較大、突起縮短的阿米巴樣類巨噬細胞。BSA對照組與常規(guī)對照組表現類似。小檗堿干預后阿米巴樣細胞數目減少,多為梭形或三角狀細胞,提示AGEs能在一定程度上改變小鼠小膠質細胞形態(tài),而小檗堿對AGEs導致的形態(tài)學改變有一定的恢復作用。2、AGEs及小檗堿對小膠質細胞活力的影響與CON組相比,不同濃度AGEs組及小檗堿組與CON組之間OD值無明顯差異(P0.05)。3、AGEs及小檗堿對小膠質細胞表面特異性蛋白CD68熒光信號的影響FITC通道下觀察:各組特異性的CD68綠色熒光信號均定位于細胞膜表面,AGEs組與常規(guī)對照組相比,綠色熒光均較對照組弱,其中300μg/mL AGEs組細胞表面綠色熒光最弱;小檗堿組綠色熒光雖較對照組偏弱,但較AGEs組有所增強;陰性對照組細胞外幾乎見不到綠色熒光。DAPI通道下觀察:各組均可見藍色熒光的細胞核。4、AGEs及小檗堿對小膠質細胞上清液中TNF-α分泌量的影響不同濃度AGEs組細胞上清液中TNF-α分泌量分別為1098、1184、1398、1433(單位pg/mL)較對照組61pg/mL顯著升高(P0.001),但各組間TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞.05)。BSA陰性對照組與CON組相比上清液中TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞0.05)。與AGEs組相比,小檗堿組細胞上清液中TNF-α分泌量無顯著性差異(P＞0.05)。5、AGEs及小檗堿對小膠質細胞活化相關蛋白表達的影響與CON組相比,AGEs組小膠質細胞中CD68、RAGE及p NF-κB p65蛋白的表達量均明顯升高(P0.01,P0.05,P0.01)。小檗堿組CD68與pNF-κBp65蛋白的表達量均較AGEs組顯著下降(P0.01,P0.05),RAGE蛋白的表達量較AGEs組沒有下降(P0.05)。[結論]1、300μg/mLAGEs培養(yǎng)小鼠小膠質細胞24h,在不影響細胞活力的條件下,可顯著上調細胞上清液中的炎性細胞因子TNF-α的分泌量,同時可增加CD68、RAGE及p NF-κ Bp65蛋白的表達。2、小檗堿可以顯著下調小鼠小膠質細胞CD68和pNF-κBp65蛋白的表達,抑制300μg/mL AGEs培養(yǎng)條件下小膠質細胞的活化,但對RAGE的表達沒有影響。[創(chuàng)新點]首次證明AGEs對小鼠小膠質細胞有活化作用及小檗堿對該活化有干預作用。這一研究結果將為闡述小檗堿改善糖尿病認知障礙,發(fā)揮腦保護作用的作用機制提供支持,為進一步尋找治療糖尿病認知障礙的中藥提供理論依據。
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

科學院北京協和醫(yī)學院邐碩士研宄生學位驗結果逡逑同濃度ＡＧＥｓ對小膠質細胞形態(tài)的影響逡逑胞貼壁生長后，按實驗分組更換成相應培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)２４ｈ后倒置相察細胞形態(tài)，如圖一所示，鏡下可見：細胞約７０－８０％貼壁良好，胞角狀，約２０—３０％懸浮生長。不同濃度ＡＧＥｓ千預２４ｈ后細胞貼壁數９０％貼壁，且隨著ＡＧＥｓ濃度的不斷升高，部分細胞活化為胞體較大阿米巴樣類巨噬細胞（見圖中紅色箭頭標記處）。另外，４００ｐｇ／ｍＬＡ數凋亡細胞（見圖中黑色箭頭標記處）。以上結果提示ＡＧＥｓ能在一小鼠小膠質細胞形態(tài)，尤以３0｛＾ｇ／ｍＬＡＧＥｓ組和４００ｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ組形顯，但４００（ａｇ／ｍＬＡＧＥｓ可能對細胞已產生毒性損傷作用。逡逑

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圖２邋ｌＯＯｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ培養(yǎng)２４ｈ后小膠質細胞形態(tài)：胞體大多呈梭狀，逡逑貼壁細胞較常規(guī)培養(yǎng)組增多；仍可見少數懸浮細胞逡逑＇邋？＇邋－邋．．．邋｜逡逑－－邐．．．邋＊邋ｖ邋－邋－邋＇邋＊＇？逡逑？邐！邋４Ｔ：邋■邋■邐．邋■．逡逑？邋＇邋．逡逑？逡逑２００Ａ逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2746248