犀角地黃湯對局灶性缺血再灌注大鼠自噬水平的影響及其調(diào)控機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間：2020-06-27 14:04

【摘要】：目的:探討中藥犀角地黃湯對局灶性腦缺血再灌注大鼠自噬水平的影響,同時(shí)研究其具體調(diào)控機(jī)制,為犀角地黃湯臨床治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)以及藥理學(xué)基礎(chǔ)。方法:通過制備大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusi on,MCAO),造模2h后實(shí)現(xiàn)再灌注。按隨機(jī)數(shù)字法將造模后的大鼠隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組(Sham group),模型組(Model group),犀角地黃湯低劑量組(XJDH,group),犀角地黃湯高劑量組(XJDH-H group),雷帕霉素組(Rapamycin group),犀角地黃湯高劑量+雷帕霉素組(XJDH-H+Rapamycin group)。觀察不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積比;透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬體的相關(guān)變化;HE染色及免疫熒光觀察腦組織病理形態(tài)改變;TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡:Western blotting檢測LC3-Ⅱ,Atg-5、p62等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.犀角地黃湯對MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響大鼠造模成功后,于再灌注第1、3、7天時(shí)間點(diǎn),由不清楚分組情況的觀察者按照Longa5級評分法進(jìn)行神經(jīng)行為評分。其中假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分為0分,行為學(xué)無改變。MCAO模型組大鼠則表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,二者比較,評分有顯著性差異(p=0.000)。其余各組大鼠在術(shù)后第1天,神經(jīng)功能評分較模型組無顯著差異(P0.05)。犀角地黃湯干預(yù)的各組大鼠在術(shù)后第3天及第7天評分較第1天相比均有不同程度的下降(所有P0.05或P0.001),且高劑量組效果更明顯。同時(shí)犀角地黃湯高劑量組大鼠的神經(jīng)功能評分低于MCAO模型組(P0.05)。結(jié)果表明犀角地黃湯可以不同程度的改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙,且高劑量組效果更明顯。2.犀角地黃湯對MCAO大鼠腦組織病理學(xué)的影響HE染色后,通過光學(xué)顯微鏡下可觀察到:假手術(shù)組的大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列較為整齊,核仁清晰可見,細(xì)胞核無深染固縮。模型組的大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變嚴(yán)重,呈空泡樣變,細(xì)胞核溶解固縮,同時(shí)神經(jīng)元脫失,多發(fā)生在腦缺血中心區(qū),周邊皮層未觀察到明顯神經(jīng)元脫失情況。雷帕霉素組大鼠的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞及缺血神經(jīng)元脫失去情況較模型組更為明顯。相比之下,犀角地黃湯低劑量組和高劑量組的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為輕度缺血性改變,未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹壞死及神經(jīng)元脫失現(xiàn)象。結(jié)果表明犀角地黃湯對腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的改善作用,高劑量的犀角地黃湯效果更加明顯。3.犀角地黃湯對MCAO大鼠梗死體積的影響核磁共振檢查發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組的腦組織無梗死,MCAO模型組大鼠明顯可見腦缺血。除雷帕霉素組,犀角地黃湯干預(yù)的各組大鼠在術(shù)后第3天及第7天腦梗死體積比較模型組均有不同程度的下降。結(jié)果提示雷帕霉素加重腦梗死體積,而不同劑量的犀角地黃湯均能一定程度減少腦缺血體積,同時(shí)高劑量組效果更佳。4.犀角地黃湯對MCAO大鼠自噬超微結(jié)構(gòu)的影響電鏡下發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器豐富,可見有少數(shù)溶酶體,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,染色質(zhì)分布正常。模型組和雷帕霉素組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)較大的損傷,細(xì)胞出現(xiàn)較多空泡,線粒體破碎,溶酶體增加,同時(shí)可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,內(nèi)部包含著未降解的細(xì)胞器(線粒體)。犀角地黃湯組與模型組相比較,神經(jīng)細(xì)胞核膜的超微結(jié)構(gòu)更加清晰完整,可見細(xì)胞內(nèi)的線粒體輕度腫脹及少數(shù)多層的自噬體結(jié)構(gòu)。雷帕霉素聯(lián)合犀角地黃湯給藥組與雷帕組相比較,自噬體明顯減少,但自噬體數(shù)量較犀角地黃湯高劑量組增多。結(jié)果表明犀角地黃湯的腦保護(hù)機(jī)制可能與減少自噬體的形成相關(guān)。5.細(xì)胞自噬激活定位運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)法,在顯微鏡下可清楚的看到模型組的LC-3Ⅱ、Beclin-Ⅰ呈現(xiàn)為綠色熒光,NeuN為紅色熒光。LC-3Ⅱ與NeuN共表達(dá)熒光強(qiáng)度最高,LC-3Ⅱ與GFAP的共表達(dá)熒光強(qiáng)度較弱,結(jié)果提示LC-3Ⅱ主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞,而小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞少見。6.犀角地黃湯對MCAO大鼠腦細(xì)胞凋亡的影響通過TUNEL細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn),犀角地黃湯給藥組凋亡細(xì)胞(綠色熒光細(xì)胞)數(shù)量較MCAO模型組明顯減少,進(jìn)一步說明犀角地黃湯可以減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷,具有神經(jīng)保護(hù)作用。而雷帕霉素組凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多,說明雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬進(jìn)一步加重腦損傷。與犀角地黃湯高劑量組相比,雷帕霉素聯(lián)合犀角地黃湯治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加,說明雷帕霉素減弱了犀角地黃湯的神經(jīng)保護(hù)作用,間接說明犀角地黃湯抗腦缺血作用與自噬密切相關(guān)。7.犀角地黃湯對MCAO大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg5、p62的表達(dá)及調(diào)控自噬分子機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組和雷帕霉素組LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表達(dá)增強(qiáng),LC3-Ⅱ/LC3-1比值增加,p62表達(dá)降低,自噬水平提高。而犀角地黃湯給藥組可以下調(diào)LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表達(dá),提高p62蛋白水平。以上結(jié)果表明,犀角地黃湯能夠抑制缺血半暗帶皮層組織LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化及P62蛋白降解過程,進(jìn)而減少自噬小體的產(chǎn)生,降低自噬水平,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用;自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin處理后進(jìn)一步加重了腦缺血程度,與犀角地黃湯聯(lián)用能降低犀角地黃湯的神經(jīng)保護(hù)作用。PI3K、mTOR和ERK是LC的上游蛋白,與自噬調(diào)控密切相關(guān)。模型組大鼠mTOR和PI3K水平降低,ERK磷酸化水平升高,犀角地黃湯可以促進(jìn)mTOR和PI3K的表達(dá),減低ERK磷酸化。結(jié)果表明,犀角地黃湯可能通過促進(jìn)AKT-mTOR信號(hào)通路,抑制ERK磷酸化,從而抑制腦缺血的自噬改善腦缺血再灌注損傷。結(jié)論:犀角地黃湯可以改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué),減輕細(xì)胞腫脹壞死及神經(jīng)元的脫失,減少腦梗死體積,減少自噬小體形成,同時(shí)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制與促進(jìn)AKT-mTOR信號(hào)通路,抑制ERK磷酸化,從而抑制自噬相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：