【摘要】：研究背景:糖脂代謝病是由糖代謝紊亂和脂代謝紊亂引起的一系列疾病的總稱,肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝的重要器官,目前大多數(shù)對糖脂代謝病的研究主要在肝臟開展。從中醫(yī)的角度來講“肝”在機(jī)體生命活動中主要起“樞紐”平衡作用,能夠協(xié)調(diào)其它臟腑功能的順利進(jìn)行。現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肝臟與腸道是同源的,二者在調(diào)控代謝方面均有重要作用。中醫(yī)藥在治療糖脂代謝紊亂有著多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。上皮細(xì)胞連接分子EpCAM已被證實(shí)對胚胎干細(xì)胞多能性的維持具有重要意義,在肝臟干細(xì)胞等多種成體干細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用,在小鼠胚胎期肝干細(xì)胞中高表達(dá),在成熟的肝細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá),而且在由肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝損傷引起的肝臟疾病的肝細(xì)胞中異常表達(dá)。當(dāng)EpCAM缺失,人和小鼠的腸道均發(fā)生先天性簇絨腸病;在前期研究中發(fā)現(xiàn)EpCAM打靶伴隨小鼠腸道緊密連接結(jié)構(gòu)改變,而這一改變會嚴(yán)重影響腸道功能,進(jìn)而對肝功能產(chǎn)生影響,但EpCAM對糖脂代謝的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。CRISPR/Cas技術(shù)作為一種最新涌現(xiàn)的基因組編輯工具,能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識別及編輯。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動物細(xì)胞,是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。運(yùn)用最新基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9獲得穩(wěn)定遺傳的EpCAM基因敲除小鼠,對該基因敲除模型小鼠進(jìn)行研究以探索EpCAM干預(yù)糖脂代謝病的功能,并在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下研究其機(jī)理。目的:1、運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù),體外構(gòu)建載體結(jié)合電轉(zhuǎn)染注射、胚胎移植、小鼠傳代等獲得穩(wěn)定遺傳的EpCAM基因敲除小鼠。2、對制作出的EpCAM基因敲除小鼠的基因敲除效果進(jìn)行驗(yàn)證。3、研究EpCAM基因缺失對腸道分化能力的影響,進(jìn)而探討對糖脂代謝的調(diào)控機(jī)制。方法:1、EpCAM基因敲除小鼠的制作:體外構(gòu)建Cas9 mRNA及gRNA載體,通過電轉(zhuǎn)染注射與胚胎移植獲得F0代小鼠并對其鑒定基因型,選取雜合基因型小鼠與C57BL/6小鼠雜交得到F1代小鼠,鑒定其具體序列。選取敲除序列完全一致的雌雄鼠自交繼而繁殖得到F2代小鼠,選取遺傳性狀穩(wěn)定的雜合F2代小鼠進(jìn)行繁育保種,并從中選取基因敲除純合子小鼠進(jìn)行分析。2、EpCAM基因敲除小鼠打靶效果及表型檢測:對EpCAM基因敲除小鼠做表型分析,腸道形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)分析,隨后對腸道緊密連接分子做Real-time PCR檢測,并結(jié)合免疫組化檢測分析。3、EpCAM基因敲除后小鼠腸細(xì)胞分化能力研究:對EpCAM基因敲除小鼠腸道組織分化細(xì)胞關(guān)鍵marker做Real-time PCR檢測,并結(jié)合免疫組化檢測分析其表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制作出EpCAM基因敲除小鼠模型并通過一系列基因鑒定確定正確敲除,同時留取雜合基因型小鼠使遺傳性狀穩(wěn)定地保種繁育。2.對EpCAM基因敲除小鼠腸道檢測發(fā)現(xiàn)表型明顯改變且各相關(guān)連接分子表達(dá)出現(xiàn)紊亂,腸細(xì)胞分化因子等相關(guān)基因發(fā)生改變。結(jié)論:首次采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制作出EpCAM基因敲除小鼠模型,進(jìn)一步研究EpCAM基因在小鼠體內(nèi)的功能,同時探明EpCAM可能通過調(diào)控腸細(xì)胞分化能力實(shí)現(xiàn)對糖脂代謝的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

（1）設(shè)計出的 Cas9 gRNA 堿基序列：EpCAM-Cas9-gRNA-F: 5’-ATA GGGCGATCCAGAACAEpCAM-Cas9-gRNA-R: 5’-TAAAAC ATCGTTGTTCTGG（2）PCR 擴(kuò)增靶點(diǎn)引物序列：EpCAM-F: CTTGGCCTGGATGGCAGCAGAATAAEpCAM-R: TCACTCACTAGGTCCTCACGCGCTC（3）EpCAM-Cas9 gRNA 堿基序列測序結(jié)果：Cas9 gRNA 堿基序列測序結(jié)果與原序列 致，說明所構(gòu)建的。體外轉(zhuǎn)錄用 gRNA 載體圖譜 Cas9 markergRNA

圖 2-2 (a)Cas9 載體模板酶切驗(yàn)證電泳圖；(b)CaFig 2-2 (a)Enzymatic digestion of Cas9 vector template vermRNA agarose gel electrophero對照組比載體模板片段小 些，說明酶切成功，載瓊脂糖凝膠成像有亮帶，說明 Cas9 mRNA 成功制2.5 本章小結(jié)該部分通過設(shè)計并合成 Cas9 gRNA 堿基序列，過堿基序列測序，測得序列與原序列 致，說明所構(gòu)同時用限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒載體，使其線性化，載體模板酶切成功即變?yōu)榫�性化模板，成功制取 CgRNA 和 Cas9 mRNA 可用作下 步的受精卵電轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2729841