【摘要】：腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated virus,AAV)是沒有致病性的,無包膜的微小病毒科的一員,由于其自身存在復(fù)制缺陷,因此只能在輔助病毒存在的條件下才能夠完成自身的復(fù)制周期。重組線相關(guān)病毒基因治療(recombinant adenoassociated virus,rAAV)載體在目前基因治療中是最常用的、極具前景的載體之一。目前rAAV已經(jīng)用于血友病、先天性黑朦、帕金森病、心力衰竭等多項(xiàng)基因治療的臨床研究中。與其他基因治療載體相比,rAAV具有高安全性、穩(wěn)定性,低致病性、免疫原性,宿主范圍廣范以及長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。全球第一個(gè)基因治療藥物正是基于rAAV1。然而,rAAV在宿主內(nèi)有限的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,導(dǎo)致了基因治療成本過高,而且高劑量的rAAV會(huì)引起機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)。細(xì)胞應(yīng)激通路是激發(fā)多種潛伏病毒生命周期的關(guān)鍵。已有文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)往往能夠引起rAAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo),甚至有些應(yīng)激源能夠代替輔助病毒的作用。考慮到中藥活性成分安全、副作用小、病人服用順應(yīng)性好等優(yōu)勢,我們選擇從中藥中篩選具有活性的單體成分作為應(yīng)激源來進(jìn)行研究。目前已經(jīng)有中藥單體成分以蛋白酶抑制劑的角色成為促進(jìn)rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物中的一員,如雷公藤紅素、扁素藤素等。丹參(Salvia miltiorrhiza bunge)是我國一類傳統(tǒng)中藥,有著悠久的歷史。文獻(xiàn)報(bào)道,丹參中的活性成分能夠影響乙肝病毒(HBV)、艾滋病毒(HIV)等病毒的生活周期,因此,本課題將主要從丹參類藥物中篩選能夠促進(jìn)rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然藥物活性成分。本文整合體外轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)建立了一套完整的中藥活性成分篩選與靶標(biāo)篩選的研究策略,以丹參為主要藥物進(jìn)行研究。首先,我們成功制備了可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的多種類型的rAAV載體,以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。其次,我們在前人實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法與策略,成功地從丹參中篩選出丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)和丹參素兩個(gè)活性成分。然后通過細(xì)胞活力、藥效關(guān)系、時(shí)效關(guān)系、穩(wěn)定性探究和普適性等實(shí)驗(yàn)對Sal B進(jìn)行了活性驗(yàn)證。結(jié)果證明,Sal B確實(shí)能夠提高rAAV在HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,該作用在多種類型細(xì)胞系中均適用。所以,我們采用免疫熒光技術(shù)來標(biāo)記rAAV載體顆粒,觀察其在細(xì)胞內(nèi)的分布以明確Sal B的作用靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)晚期內(nèi)涵體是Sal B的作用靶點(diǎn)。綜上所述,通過以上策略,我們成功地從丹參中篩選出兩個(gè)活性成分,并且通過細(xì)胞成像技術(shù)篩選得到了Sal B的作用靶點(diǎn),闡明了Sal B提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的作用機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284
【圖文】：

AAV結(jié)構(gòu)示意圖

1.1.2 AAV 的生活周期AAV 的感染方式分為潛伏性感染和裂解性感染。AAV 擔(dān)負(fù)感染宿主時(shí)，由于沒有輔助病毒的輔助 AAV 病毒基因組在整合到宿主細(xì)胞染色體后，隨著宿主自身的復(fù)制而復(fù)制。在潛伏性感染中，AAV 進(jìn)入細(xì)胞核后開始進(jìn)行脫衣殼的環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，使其發(fā)生有限的表達(dá)，進(jìn)而抑制這種病毒基因的更進(jìn)一步表達(dá)以及其的復(fù)制，這一過程就是病毒在細(xì)胞內(nèi)建立的潛伏性感染。AAV 的裂解性感染往往伴隨著輔助病毒共感染宿主細(xì)胞的發(fā)生而發(fā)生。以腺病毒為例，發(fā)生共感染時(shí)，腺病毒提供 E1a、E1b、E2a、E4 和 VA RNA 等基因來輔助 AAV 的感染，但不提供與腺病毒 DNA 復(fù)制直接相關(guān)的 E2b 基因。這種輔助功能也在一定程度上 反映了腺病毒感染對宿主 DNA 合成機(jī)制的影響。病毒感染宿主細(xì)胞后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程如下（圖 1.2）：

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2729899