【摘要】：目的:本研究應(yīng)用脂多糖(LPS)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)構(gòu)建炎癥模型,利用分子生物學、細胞生物學等研究方法,從體外實驗驗證模型細胞炎癥反應(yīng)與5-HT信號通路相關(guān)性,同時觀察益氣健脾方含藥血清對模型細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用并探討其機制,進一步豐富從脾論治AS,以期為中醫(yī)藥靶向治療心血管疾病提供了參考和借鑒。材料與方法:1.血清的制備24只SPF級雄性8周齡SD大鼠,隨機分為4組:正常組、模型組、益氣健脾方組和阿托伐他汀組,正常組與模型組用生理鹽水進行灌胃,后兩組分別應(yīng)用益氣健脾方、阿托伐他汀灌胃,每日1次,持續(xù)7天。在最后一次給藥2h后,從腹主動脈取血,離心,收集上清液,合并同組的含藥血清,使用0.22μm一次性濾器對其進行無菌過濾,儲存在-80℃冰箱中備用。2.益氣健脾方對LPS誘導HUVECs炎癥反應(yīng)的作用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),隨機分為4組:正常組、模型組、益氣健脾方組和阿托伐他汀組。除正常組外,其余各組均采用LPS(1.5μg/ml)刺激HUVECs24h,同時正常組與模型組應(yīng)用正常血清、治療組應(yīng)用相應(yīng)藥物血清分別對相應(yīng)組的細胞進行干預,并分為三個干預時間點即2h、4h、8h(分別在22h、20h、16h加入藥物),統(tǒng)一于24h后收集細胞,使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測分析各組細胞因子IL-6、TNF-α、5-HT表達的變化以及不同干預時間對療效的影響。3.益氣健脾方改善LPS誘導HUVECs炎癥水平的機制研究體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),隨機分為6組:正常組、模型組、拮抗劑組、益氣健脾方組、益氣健脾方+拮抗劑組及阿托伐他汀組。除正常組外,其余各組均采用LPS(1.5μg/ml)刺激HUVECs 24h,同時分別用正常血清、正常血清+拮抗劑、益氣健脾方血清、益氣健脾方血清+拮抗劑和阿托伐他汀血清對相應(yīng)組細胞進行干預8h(在16h后加藥),統(tǒng)一于24h后收集細胞。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測PKC、p-PKC、NF-κB蛋白的表達;使用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Real-time PCR)檢測PKC、NF-κB的m RNA的表達。結(jié)果:1.HUVECs細胞中白細胞介素-6(IL-6)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組IL-6表達明顯升高(P0.05);與模型組比較,益氣健脾方組、阿托伐他汀組的IL-6的表達出現(xiàn)下調(diào)(P0.05或p0.01)。實驗將益氣健脾方組分三個時間梯隊(2h、4h、8h)對模型細胞進行干預,與模型組比較,從統(tǒng)計學分析8h效果相對最佳。2.HUVECs細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組中TNF-α表達升高(P0.05);與模型組比較,益氣健脾方組、阿托伐他汀組的TNF-α的表達出現(xiàn)下調(diào)(P0.05或p0.01)。實驗將益氣健脾方組分三個時間梯隊(2h、4h、8h)對模型細胞進行干預,與模型組比較,從統(tǒng)計學分析8h效果相對最佳。8h干預條件下,益氣健脾方組與阿托伐他汀組比較,TNF-α表達差異不顯著(P0.05)。3.HUVECs細胞中5-羥色胺(5-HT)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組中5-HT表達升高(P0.05);與模型組比較,益氣健脾方組、阿托伐他汀組的5-HT表達出現(xiàn)下降(P0.05或p0.01)。實驗將益氣健脾方組分三個時間梯隊(2h、4h、8h)對模型細胞進行干預,與模型組比較,從統(tǒng)計學分析8h效果相對最佳。8h干預條件下,益氣健脾方組與阿托伐他汀組比較,5-HT表達差異不顯著(P0.05)。4.HUVECs細胞中蛋白激酶C(PKC)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組PKC蛋白及m RNA表達量顯著升高(P0.01);與模型組比較,拮抗劑組PKC蛋白及m RNA的表達量下降(P0.05),其余各治療組PKC蛋白及m RNA表達量均明顯下降(P0.01);與拮抗劑組比較,益氣健脾方組、益氣健脾方+拮抗劑組PKC蛋白及m RNA表達量均顯著下降(P0.01)。綜上,各治療組相比療效依次為益氣健脾方+拮抗劑組阿托伐他汀組益氣健脾方組拮抗劑組。5.HUVECs細胞中磷酸化蛋白激酶C(p-PKC)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組p-PKC蛋白表達量顯著升高(P0.01);與模型組比較,各治療組p-PKC蛋白表達量均明顯下降(P0.01);與拮抗劑組比較,益氣健脾方組、益氣健脾方+拮抗劑組p-PKC蛋白表達量均顯著下降(P0.01)。綜上,各治療組相比療效依次為益氣健脾方+拮抗劑組阿托伐他汀組益氣健脾方組拮抗劑組。6.HUVECs細胞中核因子κB(NF-κB)的表達結(jié)果與正常組比較,模型組NF-κB蛋白及m RNA表達量顯著升高(P0.01);與模型組比較,拮抗劑組NF-κB蛋白及m RNA的表達量下降(P0.01或P0.05),其余各治療組的NF-κB蛋白及m RNA表達量均明顯下降(P0.01);與拮抗劑組比較,益氣健脾方組、益氣健脾方+拮抗劑組NF-κB蛋白及m RNA表達量均顯著下降(P0.01)。綜上,療效依次為益氣健脾方+拮抗劑組阿托伐他汀組益氣健脾方組拮抗劑組。結(jié)論:1.經(jīng)LPS誘導的HUVECs中出現(xiàn)促炎細胞因子IL-6、TNF-α的上調(diào),同時在各組炎癥模型細胞中均發(fā)現(xiàn)5-HT的分泌增加,提示5-HT的過度分泌與內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)可能是共同促進AS發(fā)生發(fā)展的機制;2.益氣健脾法中藥復方(益氣健脾方)能夠通過5-HT2A受體靶向調(diào)控動脈粥樣硬化免疫炎癥過程,改善炎癥因子分泌,抑制5-HT及其下游PKC-NF-κB信號通路活化,這可能是該方干預早期AS的重要機制靶點之一;3.益氣健脾方與5-HT2A受體拮抗劑均可改善模型細胞的炎癥反應(yīng),療效前者優(yōu)于后者,提示益氣健脾方可能是在進一步拮抗5-HT信號轉(zhuǎn)導通路的基礎(chǔ)上,以發(fā)揮改善內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)的作用,從而干預早期AS的發(fā)生發(fā)展。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

論文一技術(shù)路線圖示

A：正常組；B：模型組；C：阿托伐他汀組；D：益氣健脾方組不同時間益氣健脾方含藥血清對人臍靜脈內(nèi)皮細胞 IL-6 表達的影響（—X** 與正常組比較 P＜0.01；# 與模型組比較 P＜0.05；## 與模型組與阿托伐他汀組比較 P＜0.05。健脾方含藥血清對LPS誘導的HUVECs促炎細胞因子TNF-α釋放的影常組外，其他各組均使用 LPS 刺激 HUVECs 24h。與正常組比較，模型上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組細胞差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或 p＜0.01）。本實驗將益氣健脾方組分h、4h、8h）并對模型細胞進行干預，結(jié)果表明：與阿托伐他汀組比較預 2h、4h 的 TNF-α表達具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），8h 的 TNF-α表＞0.05）；與模型組比較，益氣健脾方組干預 8h 比干預 2h、4h 的統(tǒng)計

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本文編號：2728828