【摘要】：目的:本論文的主要研究目的是基于藥物代謝途徑,通過研究復(fù)方黃黛片中君藥雄黃在體內(nèi)的代謝命運,來揭示含砷制劑中有毒成分三氧化二砷的代謝行為。根據(jù)三氧化二砷在體內(nèi)的代謝行為,找到含砷制劑毒性作用的新機(jī)制,為下一步探索解毒機(jī)制提供線索。同時,通過對復(fù)方黃黛片中單藥與雄黃的配伍研究,初步闡釋配伍減毒的可能線索,希望為其他含砷復(fù)方制劑的研發(fā)以及臨床安全使用提供有用的實驗依據(jù)。方法:本論文的研究分三個部分展開。第一部分,為研究無機(jī)砷毒性,本實驗采用CCK8法檢測三氧化二砷對不同細(xì)胞系細(xì)胞的生長抑制作用。在確證三氧化二砷對白血病細(xì)胞的膜毒性以及誘導(dǎo)凋亡作用時,引用流式細(xì)胞術(shù)檢測了白血病細(xì)胞的凋亡和活性氧的含量;凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測則采用了實時熒光定量PCR、免疫印跡試驗(Western blot)技術(shù);同時利用ELISA法檢測脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽(GSH)等膜損傷相關(guān)指標(biāo)。第二部分,為進(jìn)一步了解無機(jī)砷的代謝途徑,本實驗確定了合適的細(xì)胞對象以及給藥濃度后,采用實時熒光定量PCR、Western blot以及相關(guān)技術(shù)檢測三氧化二砷、丹參酮ⅡA和靛玉紅對CYP450酶系統(tǒng)和As3MT的表達(dá)影響;并采用小分子RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法進(jìn)一步解釋了三氧化二砷、丹參酮ⅡA和靛玉紅對As3MT的表達(dá)的影響;同時利用ELISA法檢測了As3MT的酶活性。第三部分,為了掌握砷在體內(nèi)代謝途徑的更多證據(jù),在動物體內(nèi)實驗中,采用高效液相聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP/MS)技術(shù),通過檢測雄黃中可溶性砷的含量以及不同價態(tài)來研究砷代謝行為。結(jié)果:結(jié)果表明,首先三氧化二砷對不同細(xì)胞系具有普遍的毒性,雖然其細(xì)胞毒性的具體機(jī)制還尚不明確,但在其使用的過程中膜毒性以及凋亡誘導(dǎo)的隱患會一直存在。接著在對三氧化二砷代謝研究中發(fā)現(xiàn),I相代謝酶不是影響砷代謝的關(guān)鍵酶,而Ⅱ相代謝酶(As3MT)才是砷代謝的重要和關(guān)鍵酶。最后在動物水平的實驗也進(jìn)一步證實了雄黃能顯著誘導(dǎo)As3MT酶活性,雄黃與丹參和青黛的配伍更加強了這一誘導(dǎo)作用,高活性的As3MT能使有毒的三價砷代謝清除加快。總結(jié):縱觀全文,本實驗研究首次以八種細(xì)胞為研究對象,從細(xì)胞活力檢測著手,確定了合適的細(xì)胞對象和給藥濃度,并以Ⅱ相代謝酶(As3MT)為關(guān)鍵點,基于代謝的角度去探討砷在體內(nèi)的代謝行為。研究發(fā)現(xiàn),一是發(fā)現(xiàn)Ⅱ相代謝酶(As3MT)是砷代謝的重要和關(guān)鍵酶,而As3MT可能是砷劑解毒的一個線索。二是配伍的實驗結(jié)果提示,含砷的復(fù)方制劑在配伍使用時,如何達(dá)到增效減毒不僅僅只有劑量的考量,體內(nèi)代謝調(diào)控也應(yīng)時刻關(guān)注�；谝陨�,本實驗研究期望含砷制劑在臨床安全使用中可以有效規(guī)避或減少毒性風(fēng)險,以及在其他含砷中藥的研發(fā)中,可以基于代謝的角度,合理配伍以達(dá)到增效減毒的目的。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 2 用流式細(xì)胞術(shù)分析暴露于三氧化二砷 24h 后的 HL-60 細(xì)胞的凋亡情況，與對照組比較*P<0.05，***P<0.001。Fig2. Flow cytometric analysis of apoptosis in HL-60 cells exposed to arsenic trioxide for 48 h. (AControl group, (B) 1μM As2O3, (C) 2μM As2O3, (D) 4μM As2O3, (E)8μM As2O3, (F)16μAs2O3,(G) 32μM As2O3.The cells were treated with various concentrations of Arsenic Trioxid(1,2,4,8,16and32μM) for 48 h. The percentages shown in each chart was the percentages apoptotic cells indicated by Q1-UR cells. The line graph (H) are from one representative set of thrindependent experiments. *p < 0.05 , ***p < 0.001 compared with control group.3.3 三氧化二砷對 HL60 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因 mRNA 與蛋白表達(dá)的影響。根據(jù)細(xì)胞活力數(shù)據(jù)，確定三氧化二砷濃度（ 1,2,4,8,16,32μM ）處理 HL6細(xì)胞后，提取總蛋白與總 RNA，通過 Western-blot 與 qRT-PCR 檢測凋亡相關(guān)蛋

圖 3 凋亡相關(guān)蛋白（Bax，Bcl-2）在蛋白和基因 mRNA 水平表達(dá)結(jié)果。（n=3），與對照組相比，***P < 0.001。Fig3. The chart shows the expression of apoptosis-related proteins and genes .And the graphic ofstatistical results for A: the expression of proteins,B:relative protein level, C and D: the expressionof genes. Apoptosis-related proteins were detected with western blotting utilizing specificantibodies, respectively. Apoptosis-related genes were detected with Real-time PCR System. ***P <0.001 compared with the control group.3.4 三氧化二砷對 HL60 細(xì)胞膜脂過氧化和膜通透性的影響為了闡明脂質(zhì)過氧化和乳酸脫氫酶產(chǎn)物可能參與三氧化二砷誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)，我們進(jìn)行了脂質(zhì)過氧化和乳酸脫氫酶滲漏試驗。圖 4 和圖 5 所示的數(shù)據(jù)分別

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本文編號：2728270