【摘要】：本試驗(yàn)通過建立脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型,菝葜正丁醇層及其純化部位與脂多糖共同干預(yù)細(xì)胞,研究菝葜的體外抗炎活性,同時(shí)進(jìn)一步探討其抗炎機(jī)制。采用超聲輔助醇提法提取菝葜,經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐級(jí)萃取,得到正丁醇萃取層,選擇皂苷吸附能力強(qiáng)的D101樹脂純化皂苷,優(yōu)化純化工藝得到D5(D101 50%乙醇洗脫層)。選擇皂苷吸附能力弱的S-8樹脂純化酚類物質(zhì)得S3,S5,S7(S-8 30%,50%,70%乙醇洗脫層)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力,確定樣品的最適濃度。脂多糖體外刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型。通過Elisa法測(cè)定細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6,篩選菝葜抗炎活性部位。通過Griess法測(cè)試細(xì)胞上清液中NO的分泌水平,并運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。采用蛋白免疫印跡(WB)檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bcl-XL、TNF-R1、p-IκBα、p-IKKβ和p-p65的蛋白表達(dá),利用細(xì)胞核染料Hochest33342檢測(cè)凋亡細(xì)胞。最后,運(yùn)用UPLC-DAD-ESI-MS推測(cè)抗炎活性部位S5和D5的化學(xué)成分及裂解方式。結(jié)果如下:(1)選擇D101與S-8型大孔樹脂分別純化菝葜正丁醇層皂苷和酚類物質(zhì),經(jīng)純化后,D101樹脂純化總皂苷含量可達(dá)78.47%(D5),S-8型樹脂純化酚類含量最高可達(dá)80.26%(S5)。(2)菝葜提取物(正丁醇層,S5,D5)不同程度的降低了RAW264.7巨噬炎癥細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌及mRNA的表達(dá)水平,同時(shí)抑制NO的分泌水平。(3)菝葜抗炎組分不同程度的下調(diào)巨噬細(xì)胞中NF-κB炎癥通路的TNF-R1、p-IκBα、p-IKKβ和p-p65蛋白表達(dá),通過抑制NF-κB通路的激活抑制炎癥,且D5的抑制效果最顯著。(4)菝葜抗炎組分不同程度的下調(diào)巨噬細(xì)胞中的促凋亡Caspase-3、和Caspase-9蛋白表達(dá),抑制了Caspase-3的轉(zhuǎn)錄,并顯著上調(diào)了抗凋亡Bcl-XL、和Bcl-2的蛋白表達(dá),且S5的調(diào)節(jié)作用最為顯著。(5)細(xì)胞熒光染色試驗(yàn)結(jié)果顯示,S5與D5都能顯著緩解脂多糖引起的細(xì)胞凋亡,且S5抗凋亡效果最明顯,與蛋白結(jié)果相對(duì)應(yīng)。(6)菝葜抗炎組分,D5主要含有偽原薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷和纖細(xì)薯蕷皂苷;S5成分為香草酸葡萄糖苷、新綠原酸、落新婦苷、槲皮素、山奈酚-3-葡萄糖鼠李糖苷及秦皮甲素。結(jié)論:菝葜正丁醇層抗炎活性組分,可能通過抑制NF-κB通路的激活,從而抑制細(xì)胞炎癥因子的分泌和轉(zhuǎn)錄,同時(shí)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制炎癥引起的細(xì)胞凋亡,最后達(dá)到抗炎的效果。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

Control 76.61±5.85 67.16±6.54 36.48±LPS 475.67±6.18##499.80±7.36##384.42±1 20μg/mL+LPS 427.35±7.21 473.22±6.32 345.62± 40μg/mL +LPS 394.33±8.39* 210.65±11.17** 245.46±53 20μg/mL+LPS 468.56±6.62 497.62±10.45 376.24±3 40μg/mL+LPS 425.26±7.62 495.85±9.23 386.76±5 20μg/mL+LPS 399.33±7.35* 369.59±9.62** 256.84±75 40μg/mL+LPS 137.22±4.91** 193.12±8.72** 135.68±97 20μg/mL+LPS 469.23±5.38 492.35±7.12 376.24±7 40μg/mL+LPS 465.51±6.18 483.42±8.46 347.56±5 20μg/mL+LPS 318.35±9.19* 252.12±9.18** 215.73±85 40μg/mL+LPS 115.17±3.62** 134.47±10.58** 128.94±1##表示 LPS 組與正常對(duì)照組進(jìn)行比較存在極顯著差異，P＜0.01。*表示樣品干預(yù)與行比較存在顯著差異，P＜0.05，**表示樣品干預(yù)與 LPS 組進(jìn)行比較存在極顯著差0.01。 菝葜正丁醇萃取物對(duì) NO 分泌的影響

如圖3-1是菝葜正丁醇層抗炎部位對(duì)NO的分泌的影響。與對(duì)照組相比，在LPS的誘導(dǎo)下，NO的分泌量顯著增加，這是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥的表現(xiàn)。加入樣品干預(yù)后，NO的分泌量得到顯著的抑制。與LPS組相比，各提取物的40 μg/mL劑量組都能顯著抑制NO的分泌。而S5低劑量組20 μg/mL有抑制趨勢(shì)，沒有顯著差異，而D5低劑量組20 μg/mL可以顯著抑制（P<0.05）。于此結(jié)果相吻合，D5 40 μg/mL劑量組相較于S5對(duì)NO的抑制作用更為顯著，可以與空白組無差異（P<0.01）。3.4 菝葜正丁醇萃取物對(duì)炎癥細(xì)胞形態(tài)的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2727929